佰莱博生物CETSA细胞热迁移技术实验服务

在新药研发及生物学研究的过程中，化合物结合的靶标蛋白鉴定是一项重要的工作。利用表面等离子共振（SPR）等生物物理技术进行蛋白和药物相互作用研究需要体外纯化的活性蛋白质，但是蛋白在纯化过程中其构象可能发生改变，所获得的药物-靶标相互作用信息不能反映活细胞内的真实情况。而且很多蛋白很难重组表达纯化，限制了利用生物物理分子互作技术鉴定化合物和蛋白的相互作用。CETSA技术可以在没有纯化的靶蛋白的情况下开展蛋白和化合物相互作用研究。

一、CETSA技术基本原理

2013年瑞典的卡罗琳斯卡 (Karolinska) 研究所开发了一种可以在体内检测药物与靶标蛋白结合强度的方法，即细胞热迁移技术 (cell thermal shift assay, CETSA)。CETSA 技术由体外热迁移技术 (thermal shift assays, TSA) 发展而来。

TSA 是基于蛋白质随着温度增加而逐渐变性的原理来表征蛋白质热稳定性的技术。执行特定功能的蛋白质在细胞内具有稳定的三维结构，但随着环境的改变 （如pH值或者温度） 蛋白的变性或解折叠就会迅速发生。对蛋白质而言，随着温度升高，部分蛋白会逐渐变性沉淀，当温度升高到某个值时，有50%的蛋白质发生变性，此时的温度称为熔解温度 (melting  point, Tm)。当温度超过 Tm 时，变性蛋白的数量大于未变性蛋白的数量，蛋白聚集呈指数增加，直至全部蛋白质分子变性聚集而沉淀。

Tm 作为蛋白质结构稳定性的指标之一，其值越高，蛋白质的热稳定性越好。Tm 与溶液的 pH 值、盐浓度以及蛋白的翻译后修饰等有关，配体的结合也会稳定蛋白质构象，从而使蛋白质的 Tm 值升高。TSA 技术广泛应用于检测药物与蛋白质在体外的相互作用，以及体外筛选特定蛋白的候选药物等、酶的热稳定性测定、保存蛋白质的制剂筛选等。

虽然 CETSA 技术和 TSA 技术原理相同，都是基于蛋白质热变性原理，但 CETSA 技术是一种在活细胞水平(培养细胞、活体组织等)鉴定靶标蛋白的新方法。加热处理细胞时， 随着温度的升高蛋白质逐渐变性沉淀，有活性的可溶性蛋白量逐渐减少，通过生化分析手段如 Western blotting 、 MALDI-TOF-MS 等就能够绘制出特定蛋白的可溶性蛋白含量随温度变化的曲线即熔解曲线。

对特定蛋白而言，可溶性蛋白量与变性蛋白量相等时的温度，或者可溶性蛋白量占总蛋白量一半时的温度，称为聚集温度(aggregation temperature) 等同于熔解温度 (Tm)。当细胞经药物处理后，药物和靶蛋白结合，使靶蛋白的热稳定性增强，Tm 值增加。根据药物处理前后 Tm 的变化情况，就可以确定靶蛋白和药物在生理水平上是否有相互作用。

每种蛋白质都有自身的熔解曲线（如图1）。随着温度的升高，蛋白质会发生降解（蓝色曲线，代表未加药）；当蛋白质结合小分子以后，该复合蛋白的熔解曲线会右移（红色虚线），即相同温度下，未降解蛋白的量会提高。CETSA 实验的样品来源十分灵活，可以是细胞，也可以是活体给药以后的组织样本。

图1 CETSA 示意图


CETSA 方法还能评估在恒定温度下，随着配体浓度增加，靶标蛋白质可溶性蛋白量的变化，绘制等温剂量反应曲线 (isothermal dose-reponse fingerprint, ITDRF)，计算药物的有效浓度，为药物的使用提供参考。根据对离心后上清中蛋白的检测方法不同，CETSA 技术发展出如下几种：基于免疫印迹 （Western-Blot，图2A） 进行检测的 WB-CETSA，主要用于对检测特定靶蛋白和化合物的结合，需要有靶蛋白的抗体。基于质谱 （图2B/2C） 的 MS-CETSA  方法利用 MS 对 CETSA 中的可溶性蛋白进行分子量的测定，再通过蛋白数据库分析该蛋白，MS-CETSA 现已被用于识别各种药物的未知靶点,提供了一个可同时观察由化合物介导的数千种蛋白质稳定性改变的方法。
图2 不同检测方法的 CETSA 技术平台


二、CETSA主要实验步骤
动物和细胞给药处理后进行裂解。
离心后取上清裂解液进行梯度或恒温加热。
离心去除加热变性沉淀的蛋白。
通过 western blot 检测并量化靶蛋白，用 graphpad 绘制CETSA溶解曲线 （CETSA melt curve）。
图3 CETSA 实验流程示意图

需提供材料：细胞、一抗，具体项目详细沟通确定
实验周期：材料到后一个月内

三、CETSA应用案例

案例一：小分子YK5、YK198、VER、MKT分别对蛋白HSC70、HSP70、HSP90α、HSP90β、HSP110热稳定性的影响 (Nature Communications)

案例二：farrerol对 UCHL3 热稳定性的影响(a,b)；farrerol 与 UCHL3中的氨基酸残基(K187) 结合 (c,d)(Nature Communications)

案例三：化合物CS对蛋白NPC2热稳定性的影响 ((Nature Communications)


佰莱博生物利用细胞热迁移技术(cell thermal shift assay, CETSA)、高内涵细胞成像分析平台、体外药筛 (AlphaScreen、ADP-Glo、TR-FRET) 等多种检测技术、与生物物理检测平台 (SPR、MST、ITC、BLI)、nanoDSF、MALS (动静态光散射)、AUC  (分析型超离)、CD (圆二色光谱技术)、Luminex 等检测技术平台交叉验证。提供生物大分子表征、生物分子互作分析、药物筛选、生物大分子稳定性分析及制剂筛选等服务。

目前，佰博莱生物分子互作平台已经具有 T 细胞的主要免疫调节因子 (Gal-1，Gal-3和Gal-9)、与糖尿病相关的胰岛素受体 (IR-A、IR-B、IGF-1R)、GLP-1R、HSA等重要靶点相关亲和力研究、血管内皮生长因子 (VEGF 121、VEGF165)、免疫球蛋白 Fc 受体 (Fcγ RI、Fcγ RIIB、Fcγ RIIIA、不同种属的FcRn) 相关亲和力研究、免疫球蛋白超家族的细胞黏附分子 (Nectin-1，Nectin-2，Nectin-3，Nectin-4) 及整合素家族 (aVβ5、ITGB1、aVβ3等) 相关亲和力等重要靶点研究亲和力检测服务以及基于AlphaScreen技术的 (EED、ERα、Galectin 3等靶点) 高通量化合物筛选服务。