一、LiP-MS技术介绍
LiP-MS( limited proteolysis coupled to mass spectrometry)，即限制性蛋白水解质谱联用技术，是一种用于筛选化合物结合靶点蛋白的实验方法。
相较于游离状态下的蛋白质，当小分子配体与靶蛋白形成复合物时，由于氢键等非共价相互作用的存在，蛋白配体复合物往往表现出更高的结构稳定性。在应用蛋白酶对样品进行处理的过程中，与配体结合的蛋白展现出增强的抗水解能力，其水解程度相较于未结合小分子的蛋白显著降低。通过蛋白质组鉴定技术，可以对实验组与对照组的差异肽段进行鉴定分析，从而筛选配体的潜在靶点蛋白。
二、LiP-MS靶蛋白垂钓技术基本步骤（实验材料以细胞裂解液为例）
1. 细胞裂解，提取总蛋白（注：使用温和的裂解液，保持蛋白活性或通过反复冻融的方法提取总蛋白）。
2. 将化合物或DMSO（对照）与总蛋白孵育，孵育后，化合物与靶蛋白结合，改变其对蛋白酶K的水解敏感性。
3. 孵育完成后，加入适量蛋白酶K水解总蛋白，水解完成后进行热处理失活蛋白酶K。
将上述蛋白溶液使用胰蛋白酶消化，质谱鉴定差异肽段。
图2 LiP-MS实验基本流程图[1]
注：图A，LiP-MS基本流程图；图B，以FixJ蛋白为例，当蛋白与化合物结合后，其R47-R67之间的部分未被蛋白酶K水解，从而保留完整的R47-R67肽段；图C，蛋白酶K处理后的样品经胰蛋白酶处理，进行质谱鉴定，由于R47-R67部分肽段未被蛋白酶K水解，在后续质谱鉴定环节，实验组与对照相比，两个具有非胰蛋白酶末端 (HT，R47-S56，M57-R67) 的肽段消失，同时相关的完整胰蛋白酶肽段 (FT，R47-R67) 增加。
三、案例介绍
Cancer Cell | LiP-MS结合SPR、分子对接技术筛选鉴定代谢物油酸、异胆酸结合靶点[2]
1、LiP-MS技术鉴定关键代谢物结合受体
在初步的研究当中，作者通过代谢组学、宏基因组测序、细胞及小鼠实验发现油酸和异胆酸是肿瘤发生中关键代谢物。
为了寻找油酸和异胆酸的结合靶点，作者采取了LiP-MS的实验方法：取50ug 从CRC细胞中提取的总蛋白，加入100um（终浓度）油酸、异胆酸以及DMSO共同孵育15min，随后加入蛋白酶K（1mg/ml）进行水解，水解完成后95℃处理5min终止反应。反应完成进行蛋白质组鉴定。
通过LiP-MS技术，作者发现ENO1、FXR1分别是油酸和异胆酸的潜在结合靶点（图1A，1B）
图1 LiP-MS鉴定油酸、异胆酸的潜在蛋白结合靶点
2、SPR（表明等离子共振）、分子对接技术验证代谢物与蛋白的结合
随后作者通过分子对接（Autodock Vina）分别预测了油酸与ENO1、异胆酸与FXR1的结合模式。对接结果显示，油酸通过烷基相互作用与ENO1的Arg49残基结合，平均结合能为-6.28 kcal/mol（图2A）；异胆酸通过氢键与FXR1的Arg70残基结合，平均结合能为-6.045 kcal/mol（图2B）。
作者进一步通过SPR（表面等离子共振）实验证明了油酸-ENO1、异胆酸-FXR1的结合。SPR实验流程：首先使用EDC和NHS激活CM5芯片，随后以10 ml/min的流速固定重组蛋白ENO1/FXR1，固定完成后，将油酸稀释5个梯度(12.5、6.25、3.125、1.5625、0 mM)，异胆酸稀释6个梯度 (50、25、12.5、6.25、3.125、0 mM)，以30ml/min的速度分别进样，120s结合、300s解离。测得油酸与ENO1间的KD值为10.6 um（图2C），异胆酸与FXR1的KD值为32.9 um（图2D）。
图2 SPR（表面等离子共振）、分子对接验证油酸-ENO1、异胆酸-FXR1结合
参考文献
[1] Piazza I, Kochanowski K, Cappelletti V, et al. A Map of Protein-Metabolite Interactions Reveals Principles of Chemical Communication. Cell. 2018;172(1-2):358-372.e23. doi:10.1016/j.cell.2017.12.006
[2] Sun Y, Zhang X, Hang D, et al. Integrative plasma and fecal metabolomics identify functional metabolites in adenoma-colorectal cancer progression and as early diagnostic biomarkers. Cancer Cell. 2024;42(8):1386-1400.e8. doi:10.1016/j.ccell.2024.07.005