细胞内蛋白相互作用：PLA邻位连接技术

1. 技术介绍

邻位连接技术（Proximity Ligation Assay，PLA）是一种高灵敏度的蛋白质相互作用检测方法。它利用特异性抗体结合目标蛋白，这些抗体连接着不同的DNA探针。当目标蛋白靠近时，DNA探针也随之邻近。DNA连接酶将邻近探针连接成完整模板，滚环扩增（RCA）技术扩增模板产生大量单链DNA，荧光标记探针检测和定量这些产物，显著放大信号，使微弱相互作用可检测。PLA技术在生物医学研究中广泛应用，包括蛋白质相互作用研究、修饰分析、药物研发等领域。 

2. 技术原理

PLA 技术通过特异性抗体结合目标蛋白，这些抗体连接着不同 DNA 探针。当目标蛋白相互靠近时，DNA 探针也随之邻近。加入 DNA 连接酶后，邻近探针连接形成完整 DNA 模板。随后，滚环扩增（RCA）技术扩增该模板，产生大量单链 DNA 产物，荧光标记寡核苷酸探针可检测和定量这些产物。RCA 显著放大信号，使微弱分子相互作用可检测。每个蛋白相互作用事件生成多个荧光信号点，灵敏度显著提高。荧光显微镜下，信号点对应目标蛋白相互作用位置（Tanabe et al., 2015; Wang et al., 2021）。

PLA 技术由瑞典科学家 Ulf Landegren 教授的学生 Simon Fredriksson 博士开发，用于检测 PDGF-BB 水平，首次将 DNA 连接和扩增技术与抗体识别结合用于蛋白质相互作用检测，为技术发展奠定基础（Fredriksson et al., 2002）。后续该团队推动技术进步，使其应用于固定细胞或组织中的蛋白质及其相互作用检测，并开发了商业化试剂盒（Gullberg et al., 2004; Söderberg et al., 2006; Klaesson et al., 2018）。

图1 邻位连接技术原理（来源：Tanabe et al., 2015） 

3. 实验流程

 PLA 技术是一种高灵敏度检测蛋白质相互作用的方法，通过 DNA 连接和扩增技术将蛋白质相互作用转化为可检测的 DNA 信号（图2）。以下是该技术的精简步骤：

（1）样品制备：固定和透化处理细胞或组织，使抗体能够进入并结合目标蛋白，同时阻断非特异性结合位点以降低背景信号。

（2）抗体孵育：使用带有DNA探针的特异性抗体标记目标蛋白。

（3）邻位连接反应：添加DNA连接酶，使邻近的DNA探针发生连接反应，形成环状或线性模板。

（4）滚环扩增（RCA）：利用聚合酶对模板进行扩增，生成大量DNA序列以放大信号。

（5）信号检测：荧光标记探针与扩增DNA结合，产生可在荧光显微镜下观察的信号，指示蛋白相互作用位置。

（6）数据分析：分析荧光信号的数量、位置和强度，评估蛋白质间的相互作用（Debaize et al., 2017）。

图2 PLA实验基本流程（Debaize et al., 2017）

4. 应用领域

 PLA 技术在生物医学研究中具有广泛应用（图3），以下为其主要应用领域：

（1）蛋白质相互作用研究：PLA 技术可检测细胞内膜蛋白、核蛋白和细胞质蛋白等的相互作用。

（2）蛋白质修饰分析：利用特异性抗体，PLA 能检测蛋白质的磷酸化、泛素化、乙酰化等修饰及其动态变化。

（3）药物研发：PLA 能评估药物对蛋白质相互作用的影响。

图3 PLA技术主要应用领域（Wang et al., 2021）

5. 技术优势

（1）高灵敏度

能够检测低丰度蛋白质及其相互作用，比传统方法如 Western blot和免疫沉淀更灵敏。

（2）高特异性

利用一对特异性抗体和 DNA 连接反应，PLA 减少了非特异性结合导致的假阳性信号。

（3）原位检测

可以在细胞或组织中原位检测，保留蛋白质的空间分布信息，反映其在生理环境中的真实状态。

（4）定量分析

荧光信号强度和数量与目标蛋白的水平相关，可实现对蛋白质相互作用和表达水平的定量分析。

6.经典案例

案例一 

2025年4月，四川大学华西医院刘伦旭团队发表论文《RNase1-driven ALK-activation is an oncogenic driver and therapeutic target in non-small cell lung cancer》中，通过邻位连接技术（Proximity Ligation Assay，PLA）研究RNase1与RAGE、以及RAGE与ALK之间的空间近邻关系。实验结果显示，RNase1与RAGE、RAGE与ALK之间均产生了显著的PLA信号，表明这三种蛋白在细胞内可形成空间邻近的复合体（Zha et al., 2025）。

图4 文中PLA实验结果（图片来自原文Fig.1）

案例二 

2025年4月，天津医科大学肿瘤医院等单位在论文《USP9X integrates TGF-β and hypoxia signalings to promote ovarian cancer chemoresistance via HIF-2α-maintained stemness》中，通过邻位连接技术（Proximity Ligation Assay，PLA）研究了USP9X与HIF-2α及SOX2之间的相互作用。研究者采用抗USP9X和抗HIF-2α/GAPDH抗体对HIF-2α过表达的OVCA8细胞进行PLA实验，证实了USP9X与HIF-2α在细胞核内存在相互作用，且TGF-β和低氧条件显著增强了这种相互作用。此外，利用抗USP9X和抗SOX2抗体进行的PLA实验显示，USP9X与SOX2在细胞核中共定位，这一现象在TGF-β和低氧处理后更加明显（Zhang et al., 2025）。

图5 文中PLA实验结果（图片来自原文Fig. 3）

07.相关技术服务

08.参考文献

[1] Fredriksson S, Gullberg M, Jarvius J, Olsson C, Pietras K, Gústafsdóttir SM, Ostman A, Landegren U. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 2002 May;20(5):473-7. PMID: 11981560.

[2] Gullberg M, Gústafsdóttir SM, Schallmeiner E, Jarvius J, Bjarnegård M, Betsholtz C, Landegren U, Fredriksson S. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jun 1;101(22):8420-4. 

[3] Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M, Ridderstråle K, Leuchowius KJ, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson LG, Landegren U. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 2006 Dec;3(12):995-1000. 

[4] Klaesson A, Grannas K, Ebai T, Heldin J, Koos B, Leino M, Raykova D, Oelrich J, Arngården L, Söderberg O, Landegren U. Improved efficiency of in situ protein analysis by proximity ligation using UnFold probes. Sci Rep. 2018 Mar 29;8(1):5400. Tanabe M, Ishino Y, Nishida H. From Structure-Function Analyses to Protein Engineering for Practical Applications of DNA Ligase. Archaea. 2015 Oct 5;2015:267570. 

[5] Wang P, Yang Y, Hong T, Zhu G. Proximity ligation assay: an ultrasensitive method for protein quantification and its applications in pathogen detection. Appl Microbiol Biotechnol. 2021 Feb;105(3):923-935.

[6] Debaize L, Jakobczyk H, Rio AG, Gandemer V, Troadec MB. Optimization of proximity ligation assay (PLA) for detection of protein interactions and fusion proteins in non-adherent cells: application to pre-B lymphocytes. Mol Cytogenet. 2017 Jul 20;10:27. 

[7] Zha Z, Liu C, Yan M, Chen C, Yu C, Chen Y, Zhou C, Li L, Li YC, Yamaguchi H, Ye L, Liu T, Wang YN, Lee HH, Yang WH, Chan LC, Ke B, Hsu JL, Ding L, Ji D, Pan P, Meng Y, Pu Y, Liu L, Hung MC. RNase1-driven ALK-activation is an oncogenic driver and therapeutic target in non-small cell lung cancer. Signal Transduct Target Ther. 2025 Apr 18;10(1):124. 

[8] Zhang Z, Yu X, Wen L, Wang J, Li Z, Zhang Y, Cheng J, Kan R, Zhang W, Shen Y, Yuan S, Zhao L. USP9X integrates TGF-β and hypoxia signalings to promote ovarian cancer chemoresistance via HIF-2α-maintained stemness. Cell Death Dis. 2025 Apr 18;16(1):312.