佰莱博生物FRET荧光共振能量转移实验服务
1. 介绍
荧光共振能量转移（Förster Resonance Energy Transfer，FRET）是一种基于荧光的非辐射能量转移过程，最初由Theodor Förster提出。FRET发生在两个分子——供体（Donor）和受体（Acceptor）之间。FRET的效率高度依赖于供体和受体之间的距离、它们的光谱重叠程度以及相对取向，因此被广泛用于测量分子间的距离和研究分子间的相互作用（Algar et al., 2019）。
2. FRET原理
FRET作为一种重要的生物物理技术，广泛应用于分子探测和细胞成像等领域。其核心原理是基于供体荧光团向邻近的受体之间的非辐射能量转移。当供体被激发后，它会以特定波长发射荧光，这一过程涉及到供体的激发态和基态之间的跃迁。然而，能量并不会总是以光子的形式释放，而是可以通过与受体的相互作用将能量转移给受体。在大多数应用中，供体和受体都是荧光蛋白，能量转移表现为供体荧光的猝灭和荧光寿命的缩短，同时伴随着受体荧光发射的增加。
根据Förster理论，FRET效率（EFRET）与两个分子之间实际距离（r）的关系如下：
其中R0是FRET效率为50%时的特征距离，也称为Förster半径。由于这种逆六次方依赖关系，FRET效率在小于R0时接近最大值，而在大于R0时迅速接近零（Lim et al., 2022）。
为了使FRET有效，供体和受体之间必须满足几个关键条件：
（1）供体-受体彼此足够靠近（通常为10~100 Å）；
（2）供体的发射光谱应与受体的激发光谱重叠；
（3）供体和受体的偶极矩不得垂直（Wu et al., 2023）。
图1 FRET的原理（Lim et al,. 2022）
3. 测量FRET的方法
现有测量FRET的方法结合了显微成像技术，通过激光共聚焦显微镜来进行，这种方法能够提供高分辨率和高灵敏度。主要方法包括：
（1）敏化发射法：通过同时激发供体和受体，并利用特定滤光片收集信号。这是最简单的方法，但需进行广泛对照实验校正串扰。
（2）受体漂白法：利用了受体在FRET过程中被淬灭，当受体被漂白时，供体荧光强度增加，从而计算FRET效率。这种方法简单且定量，但每个细胞只能使用一次。
（3）荧光寿命成像显微镜（FLIM）：通过测量供体荧光寿命变化来确定FRET效率，不易受到串扰伪影影响，但设备复杂且成本较高。
（4）光谱成像：收集供体和受体整个发射光谱，分析重叠区域，以准确测定FRET水平。
（5）荧光偏振成像：基于偏振光对荧光分子的选择性激发，以提供高信噪比的数据，用于区分FRET存在与否。
在细胞生物学研究中，敏化发射法和受体者漂白法最常用，因为这些方法简单易行，而FLIM和光谱成像则适合需要更高精度分析的实验（Lim et al., 2022）。
图2 测量FRET的不同方法（Lim et al,. 2022）
3. FRET实验优势
（1）可以对天然状态蛋白进行体内研究。
（2）直接可视化交互式蛋白质的亚细胞定位。
（3）易于执行且即时数据采集。
（4）高灵敏度，可以检测获瞬态相互作用。
（5）提供定量数据集且最小化样品损伤。
4. 实验流程
FRET实验通常包括以下几个步骤：
（1）选择合适载体：选择合适的供体与受体荧光蛋白，并将其融合到目标分子上。
表1 FRET实验常用的荧光蛋白对的特性（来源：www.microscopyu.com）
（2）细胞培养：根据实验目的培养特定细胞用于转染。
（3）细胞转染：将构建好的质粒共转化到目的细胞。
（4）检测FRET：通过荧光显微镜观察并记录信号。
（5）数据分析：计算并分析FRET效率及两者相互作用强度。
图3 光漂白FRET成像技术的标准流程（图片来源：Chial et al,. 2010）
5. 应用类型
FRET技术因其多功能性，在多个领域有广泛应用，包括：
（1）蛋白质相互作用研究；
（2）细胞内信号传导监测；
（3）药物筛选与开发；
（4）活体成像。
6. FRET技术经典案例
在2024年，吉林大学第一医院张文艳教授团队发表文章《CRL4B E3 ligase recruited by PRPF19 inhibits SARS-CoV-2 infection by targeting ORF6 for ubiquitin-dependent degradation》，通过受体漂白法发现CFP-PRPF19与ORF6存在空间位置接近且相互作用强度显著增强（Zhang et al., 2024）。
文中受体光漂白FRET实验结果（图片来自原文Fig. S3）
7. 相关技术服务
8. 参考文献
[1] Algar WR, Hildebrandt N, Vogel SS, Medintz IL. FRET as a biomolecular research tool- understanding its potential while avoiding pitfalls. Nat Methods. 2019 Sep;16(9):815-829.
[2] Lim J, Petersen M, Bunz M, Simon C, Schindler M. Flow cytometry based-FRET: basics, novel developments and future perspectives. Cell Mol Life Sci. 2022 Mar 30;79(4):217.
[3] Chial HJ, Lenart P, Chen YQ. APPL proteins FRET at the BAR: direct observation of APPL1 and APPL2 BAR domain-mediated interactions on cell membranes using FRET microscopy. PLoS One. 2010 Aug 30;5(8):e12471.
[4] Zhang L, Hao P, Chen X, Lv S, Gao W, Li C, Li Z, Zhang W. CRL4B E3 ligase recruited by PRPF19 inhibits SARS-CoV-2 infection by targeting ORF6 for ubiquitin-dependent degradation. mBio. 2024 Feb 14;15(2):e0307123.