佰莱博生物双荧光素酶报告实验（植物）服务


1. 介绍

双荧光素酶报告实验（Dual-Luciferase Reporter assay，Dual-LUC）是一种广泛应用于分子生物学和生物化学研究中的技术，主要用于测定基因表达、启动子活性检测以及其他生物学过程。

 

2. Dual-LUC实验原理

荧光素酶是一类催化荧光素等物质氧化发光的酶，其技术基础源于荧光素酶的发现与应用。1996年，美国普洛麦格公司（Promega Corporation）推出了Dual-Luciferase Reporter Assay System，结合了萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase，Fluc）和海肾荧光素酶（Renilla luciferase，Rluc），使研究人员能够在同一实验中同时测量两种不同的荧光素酶活性。

萤火虫荧光素酶是一种分子量为61 kDa的单体蛋白，具有翻译后即有活性的特点，可以作为报告基因立即发挥功能。在需要ATP、Mg2+和O2的反应中，萤火虫荧光素通过氧化生成光子发射（图1）。在常规反应条件下，氧化过程通过转化速度极慢的萤光素化-AMP（luciferyl-AMP）中间体实现，因此该检测方法产生的“闪光”型光信号在底物和酶混合后迅速衰减。

海肾荧光素酶则是分子量为36 kDa的单体蛋白，同样在翻译后可立即作为报告基因发挥作用。海肾荧光素酶催化的发光反应需要氧气和腔肠素（Coelenterazine）作为底物（图1）。

图1 荧光素的发光原理（来自Promega官网）

Dual-LUC实验中，首先将目标启动子（Target promoter）作为Fluc基因启动子，形成报告载体（Reporter），该载体还包含一个35S启动子启动的Rluc基因。同时，另外构建一个由强启动子（如35S启动子）启动表达的目标转录因子的激活子载体（Effector），通过根癌农杆菌将这两个载体共同转染到烟草细胞中。在细胞内，目标启动子的活性会影响Fluc的表达，而Rluc作为内参提供稳定的对照信号，以观察过表达的特定的转录因子（TF）对目标启动子的调控作用。如果转录因子激活了目标启动子，Fluc的表达水平将增加；反之则降低（Gao et al，2020）。最后，通过测量Fluc与Rluc荧光信号的比值，可以定量分析目标启动子的活性及其对转录因子的响应，还可以通过成像系统进行定性评估。

图2 Dual-LUC实验原理

随着技术的发展，Dual-LUC实验已经被广泛应用于植物转录因子和启动子的互作（Khan et al，2019），miRNA与靶基因的互作（Wang et al，2018），以及miRNA和lncRNA/ circRNA的靶向互作（Lu et al，2020）。

Dual-LUC实验的优势：

（1）双重检测：通过同时检测两种荧光素酶的活性，可以消除实验中的一些变异因素，例如细胞活性和转染效率，从而提高结果的可靠性。

（2）高灵敏度：荧光素酶的反应具有较高的灵敏度，可以检测到低丰度的报告基因。

（3）实时监测：该方法可以实时监测基因表达变化，适合动态研究。

（4）简便易行：操作相对简单，适合高通量筛选。

 

3. 实验流程

Dual-LUC实验一般步骤包括以下几个部分，详见图3（Khan et al，2019）。

（1）载体构建：将目标基因与两个不同的荧光素酶基因（如Rluc和Fluc）克隆到质粒中。

（2）农杆菌转化：将构建好的质粒分别转化到农杆菌细胞中。

（3）烟草瞬时转化：将含有目的质粒的农杆菌注射到烟草也背面。

（4）添加底物：在实验结束时，向细胞裂解上清中添加相应的荧光素酶底物。

（5）测定发光强度：

定量检测：使用荧光酶标仪或其他发光检测设备分别测定两种荧光素酶的发光强度。

定性检测：使用化学发光成像仪拍摄烟草叶片观察其发光强度。

（6）数据分析：根据发光强度计算相对表达量，并进行统计分析。

图3 Dual-LUC实验一般流程

 

4. 应用类型

（1）基因表达研究：用于评估特定基因在不同条件下的表达水平。

（2）信号通路分析：研究信号通路激活或抑制对目标基因表达的影响。

（3）转录因子活性检测：通过构建含有转录因子结合位点的报告系统来检测转录因子的活性。

 

5. Dual-LUC实验经典案例

在2023年，华中农业大学徐强教授团队的研究文章《Pangenome analysis provides insight into the evolution of the orange subfamily and a key gene for citric acid accumulation in citrus fruits》中，通过Dual-LUC实验发现，CitPH4可以增强CitPH5启动子的转录活性。此外，PH4和PH4-AN1复合物对AbPH5启动子的诱导作用弱于对CitPH5启动子的诱导。进一步实验表明，AbPH5启动子中存在一个85 bp的缺失区域，该区域包含一个MYB结合位点（MBS）。添加该MBS可以增强PH4对AbPH5启动子的诱导作用，而在CitPH5启动子中删除MBS则显著降低了PH4的诱导效果（Huang et al，2023）。

文中Dual-LUC实验结果（图片来自原文Figure 6）

 

参考文献

[1] Gao Y, Xu Z, Zhang L, Li S, Wang S, Yang H, Liu X, Zeng D, Liu Q, Qian Q, Zhang B, Zhou Y. MYB61 is regulated by GRF4 and promotes nitrogen utilization and biomass production in rice. Nat Commun. 2020 Oct 15;11(1):5219.

[2] Khan A, Shrestha A, Dey N. Biochemical and Molecular Characterization of Novel Pararetroviral Promoters in Plants. Methods Mol Biol. 2019;1991:223-236.

[3] Wang H, Yao H, Yi B, Kazama K, Liu Y, Deshpande D, Zhang J, Sun J. MicroRNA-638 inhibits human airway smooth muscle cell proliferation and migration through targeting cyclin D1 and NOR1. J Cell Physiol. 2018 Jan;234(1):369-381.

[4] Lu S, Zhu N, Guo W, Wang X, Li K, Yan J, Jiang C, Han S, Xiang H, Wu X, Liu Y, Xiong H, Chen L, Gong Z, Luo F, Hou W. RNA-Seq Revealed a Circular RNA-microRNA-mRNA Regulatory Network in Hantaan Virus Infection. Front Cell Infect Microbiol. 2020 Mar 13;10:97.

[5] Huang Y, He J, Xu Y, Zheng W, Wang S, Chen P, Zeng B, Yang S, Jiang X, Liu Z, Wang L, Wang X, Liu S, Lu Z, Liu Z, Yu H, Yue J, Gao J, Zhou X, Long C, Zeng X, Guo YJ, Zhang WF, Xie Z, Li C, Ma Z, Jiao W, Zhang F, Larkin RM, Krueger RR, Smith MW, Ming R, Deng X, Xu Q. Pangenome analysis provides insight into the evolution of the orange subfamily and a key gene for citric acid accumulation in citrus fruits. Nat Genet. 2023 Nov;55(11):1964-1975.