佰莱博生物TPP热蛋白质组学实验服务
一、TPP（热蛋白质组学）技术介绍
TPP(Thermal Proteome Profiling)，即热蛋白质组分析技术，是一种用于研究化合物结合靶点的实验方法。
相较于游离状态下的蛋白质，蛋白质与小分子配体结合形成的复合物，由于氢键等非共价键的协同作用，其热稳定性往往高于游离状态下的蛋白质。经过加热处理后，与配体结合的蛋白质变性沉淀的程度显著低于未结合配体的蛋白质。因此，可通过热处理-高速离心的方法富集可溶性蛋白，并采用 SDS-PAGE 电泳结合定量蛋白质组学对差异可溶性蛋白质进行鉴定分析，从而筛选并确认配体的潜在靶标蛋白。
二、TPP靶蛋白垂钓技术基本步骤（实验材料以细胞裂解液为例）
1. 细胞裂解，提取总蛋白（注：使用温和的裂解液，保持蛋白活性或通过反复冻融的方法提取总蛋白）。
2. 将化合物或DMSO（对照）与总蛋白孵育，孵育后，化合物会与靶蛋白结合，改变其热稳定性。
3. 孵育完成后，在不同温度下进行热处理，处理完成后，高速离心去除变性沉淀的蛋白质。
将上述蛋白溶液使用胰蛋白酶消化，质谱鉴定差异肽段。
图2 TPP实验基本流程图[1]
三、案例介绍
Nature commun| TPP结合CETSA、MST、分子动力学模拟技术筛选鉴定天然代谢产物FBP结合靶点[2]
1、TPP技术鉴定天然代谢产物FBP结合受体
为了寻找FBP的结合靶点，作者采取了TPP的实验方法：从HepG2细胞中提取总蛋白，稀释到2mg/ml，加入5um（终浓度）FBP或者水（对照）共同孵育30min（25℃），随后分成6等份，转移到PCR管中，于37-62℃热处理3min。热处理完成后高速离心，取上清进行质谱鉴定。
通过TPP技术，作者鉴定到了66个高度可信的FBP靶点，包括GAPDH、PGAM1等蛋白（图1c）。
图1 TPP鉴定FBP潜在蛋白结合靶点
2、CETSA、MST（微量热泳动）验证代谢物与蛋白的结合
作者首先通过CETSA验证了代表性的蛋白靶点，包括热稳定性增加的PGAM1、PMM2和PRPS1以及热稳定性降低的GARS、HDAC2等蛋白（图2a），并且通过重组蛋白的热稳定性实验证明了这一点（图2b）。
作者进一步通过MST（微量热泳动）实验证明了FBP-PGAM1、FBP-PGM1、FBP-PMM2的结合。MST实验流程：首先使用氨基偶联试剂盒对PGAM1、PGM1、PMM2重组蛋白进行荧光标记，标记完成后将蛋白与FBP室温下避光孵育30min，然后使用Monolith NT.115仪器进行检测。测得FBP与PGAM1间的KD值为166 um，FBP与PGM1的KD值为235 um，FBP与PMM2的KD值为247 um（图2c），这种微弱的相互作用与之前对内源性代谢物与其靶蛋白之间相互作用的观察一致。
图2 CETSA、MST（微量热泳动）验证FBP-PGAM1结合
3、LC-MS/MS、分子对接及分子动力学模拟研究FBP发挥功能的分子机制
作者通过LC-MS/MS发现FBP能够磷酸化PGAM1的His11，并且FBP的C1和C3位上的磷酸都能够转移到PGAM1上（图3a、3b）。为了探究这一分子机制，作者首先通过分子对接，发现当FBP上的C1提供磷酸基团时，磷酸基团能与Arg10、Gly187、Arg62以及His186形成氢键作用；同时，当FBP上的C3提供磷酸基团时，磷酸基团能与Arg10、Arg62以及His186形成氢键作用，这与之前的LC-MS/MS结果一致（图3c）。并且根据分子对接结果，作者构建了6个点突变，通过WB磷酸化检测以及MST实验确定Arg10、Glu89或His186的突变严重损害了FBP对PGAM1的结合和组氨酸磷酸化（图3d）。同时，作者分别进行了750ns的分子动力学模拟，证明不论是C1还是C3，都能和PGAM1的活性位点稳定结合（图3e）。
图3 LC-MS/MS结合分子对接、分子动力学模拟探究FBP发挥功能的分子机制
参考文献
[1] Mateus A, Määttä TA, Savitski MM. Thermal proteome profiling: unbiased assessment of protein state through heat-induced stability changes. Proteome Sci. 2017;15:13. Published 2017 Jun 24. doi:10.1186/s12953-017-0122-4
Zhang Y, Cao Y, Wu X, et al. Thermal proteome profiling reveals fructose-1,6-bisphosphate as a phosphate donor to activate phosphoglycerate mutase 1. Nat Commun. 2024;15(1):8936. Published 2024 Oct 16. doi:10.1038/s41467-024-53238-w