细胞内蛋白相互作用检测：双分子荧光互补（BiFC）实验服务 

1. 技术介绍

 双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation，BiFC）实验是一种用于研究蛋白质相互作用的技术。该实验通过将两个不完全的荧光蛋白片段分别融合到两个待研究的蛋白质上，当这两种蛋白质相互作用时，两个荧光蛋白片段会结合形成一个完整的荧光蛋白，从而发出可检测的荧光信号。这种方法可以在活细胞中实时观察蛋白质之间的相互作用。

2. 技术原理

BiFC是一种基于蛋白质-蛋白质相互作用的可视化技术。该技术利用荧光蛋白的两个片段，例如YFP蛋白的N端和C端，分别与待检测的两个蛋白质融合，当这两个蛋白质发生相互作用时，两个荧光蛋白片段会重新组装，恢复荧光信号，从而可以在荧光共聚焦显微镜中直接观察到蛋白质相互作用的发生（如图1）。

BIFC技术最初由Regan和同事在2000年报道，他们首次实现了除了绿色荧光蛋白（GFP）片段的荧光互补。之后Kerppola等人在2002年成功应用于哺乳细胞中，使BIFC技术得到更广泛的应用。现如今，除了GFP蛋白外，还有黄色荧光蛋白（YFP）、红色荧光蛋白（mCherry）等蛋白用于BiFC实验（Miller et al., 2015）。

图1 BiFC实验原理（来源：Miller et al., 2015）

3. 实验流程

BiFC实验通常包括以下步骤：

（1）构建表达载体：将感兴趣的基因克隆到带有不同荧光蛋白片段（如YFP-N和YFP-C）的表达载体中。

（2）转染/转化细胞：将构建好的表达载体转染到目标细胞中（动物细胞可用脂质体法，植物细胞可用农杆菌介导法）。

（3）培养细胞：在适宜条件下培养转染后的细胞，以确保目标蛋白表达。

（4）观察荧光信号：使用荧光共聚焦显微镜观察细胞中的荧光信号。

（5）数据分析：评估蛋白质间的相互作用。

4. 应用领域

BiFC技术在多个研究领域中展现出广泛的应用潜力：

（1）蛋白质-蛋白质相互作用的研究。

（2）信号通路分析。

（3）细胞分化过程中的蛋白质复合物动态变化。

（4）植物中蛋白质复合物的检测。

5. 技术优势

实时监测：BiFC允许在活细胞中实时观察蛋白质相互作用，而无需破坏细胞。

空间特异性：在亚细胞部位观察到蛋白质相互作用，有助于理解其功能和机制。

高灵敏度：即使是弱相互作用也能被检测到，因为只要有结合，就会产生荧光信号。

适用性广泛：可以用于多种类型的细胞（植物、动物及微生物等）。

6.经典案例

案例一 

在2025年，中国科学院大学杨运煌团队发表文章《Structural insights into a highly flexible zinc finger module unravel INSM1 function in transcription regulation》，通过BiFC实验发现，哺乳动物神经内分泌分化的关键调节因子INSM1可以和TEAD1、CTCF、NEUROD1和FOXA2蛋白在细胞核中发生相互作用（Zhou et al., 2025）。

案例二 

在2024年，西南大学何光华团队发表文章《Natural variation in the promoter of qRBG1/OsBZR5 underlies enhanced rice yield》，通过BiFC实验发现，水稻中qRBG1与OsGSK2在细胞核中相互作用，另外qRBG1和OsBZR1也在细胞核中形成同源或异源二聚体（Zhang et al., 2024）。

图4 文中BiFC实验结果（来源：原文Fig.4）

07.相关技术服务

08.参考文献

[1] Ghosh I, Hamilton AD, Regan L. Antiparalle leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein. J Am Chem Soc. 2000 May 24;122(23):5658-9.

[2] Hu CD, Chinenov Y, Kerppola TK. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 2002 Apr;9(4):789-98.

[3] Miller KE, Kim Y, Huh WK, Park HO. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Analysis: Advances and Recent Applications for Genome-Wide Interaction Studies. J Mol Biol. 2015 Jun 5;427(11):2039-2055.

[4] Zhou H, He X, Xiong Y, Gong Y, Zhang Y, Li S, Hu R, Li Y, Zhang X, Zhou X, Zhu J, Yang Y, Liu M. Structural insights into a highly flexible zinc finger module unravel INSM1 function in transcription regulation. Nat Commun. 2025 Mar 4;16(1):2162.

[5] Zhang Q, Wu R, Hong T, Wang D, Li Q, Wu J, Zhang H, Zhou K, Yang H, Zhang T, Liu J, Wang N, Ling Y, Yang Z, He G, Zhao F. Natural variation in the promoter of qRBG1/OsBZR5 underlies enhanced rice yield. Nat Commun. 2024 Oct 3;15(1):8565.