细胞内蛋白相互作用-PL邻近标记技术

1. 技术介绍

 邻近标记技术（Proximity Labeling，PL）是一种用于研究蛋白质相互作用的新兴工具，其原理是借助特定酶将标记物共价连接到目标蛋白附近的蛋白质上，以便标记和分析邻近蛋白质，进而借助质谱技术检测揭示蛋白质间相互作用关系。该技术在捕捉蛋白质相互作用、解析亚细胞器蛋白质组、研究动态相互作用、发现靶点蛋白等诸多领域有着广泛应用。

2. 技术原理

邻近标记技术的核心原理是利用特定的酶将标记物（如生物素）共价连接到目标蛋白附近的蛋白质上，从而实现对邻近蛋白质的标记和后续分析。这种标记可以通过质谱技术进行检测，进而揭示蛋白质之间的相互作用关系。

2004年Cronan等首次提出用生物素连接酶进行邻近标记的概念，使用的BirA-R118G突变体对活化生物素亲和力降低，会非特异性标记邻近蛋白质（Choi-Rhee et al., 2004）。2012年Roux等将其命名为BioID，并用于哺乳动物细胞实验。后来又出现TurboID技术及依赖过氧化氢刺激的APEX和辣根过氧化物酶（HRP）技术（Qin et al., 2021; Liu et al., 2024）。如下图1a和图1b所示，根据是否依赖过氧化氢（H₂O₂）刺激，邻近标记技术可分为两大类：

（1）依赖H₂O₂邻近标记以抗坏血酸过氧化物酶（APEX）和辣根过氧化物酶（HRP）为代表。APEX是在H₂O₂存在的情况下，能够催化标记反应生成自由基，这些自由基与邻近的蛋白质发生共价反应，从而实现邻近标记。HRP则是在H₂O₂存在下，催化DAB等底物发生氧化反应，生成具有反应性的中间产物，这些产物可与邻近蛋白质的侧链基团发生共价结合，进而实现标记。APEX的快速标记特性更适用于捕捉核酸-蛋白相互作用等常涉及复杂动态的过程。

（2）不依赖H₂O₂的邻近标记包括BioID及其衍生技术（如BioID2、Split-BioID等）和TurboID及其衍生技术（如miniTurbo、Split-TurboID等）。这些技术使用生物素连接酶，通过催化ATP与生物素之间的化学反应将生物素连接到蛋白质的赖氨酸残基上。当这种连接酶与目标蛋白融合后，它可以将生物素连接到目标蛋白邻近的其他蛋白上。此类技术无需外加刺激，操作更简便且应用范围广，已成为主流。

图1  邻近标记技术原理（来源：Qin et al., 2021）

3. 实验流程

以TurboID邻近标记技术为例（Knecht et al., 2023），其实验步骤通常包括以下几个关键环节：

（1）构建融合蛋白表达载体：将目标蛋白编码序列与TurboID编码序列融合，构建表达载体。

（2）转染细胞：把融合蛋白表达载体转染到目标细胞系中。

（3）培养和诱导细胞：在培养基中添加生物素，培养细胞并进行标记。

（4）细胞裂解和富集：裂解细胞后，利用链霉亲和素磁珠富集生物素标记的蛋白质。

（5）质谱分析：对蛋白质进行消化和质谱分析，鉴定与目标蛋白相互作用的蛋白质。

图2  以TurboID为例的邻近标记实验流程（来源：Knecht et al., 2023）

4. 应用领域

邻近标记技术在蛋白质研究中具有广泛应用（Yang et al., 2020）：

捕捉蛋白质相互作用：可捕捉瞬时或弱亲和力的蛋白质相互作用，弥补传统技术不足。

解析亚细胞器蛋白质组：TurboID和APEX等技术可用于解析亚细胞器中蛋白质的组成。

研究动态相互作用：TurboID和APEX2等技术助力在短时间内捕捉动态蛋白质相互作用。

发现标志物或靶点蛋白：可用于研究药物与其靶蛋白和RNA的相互作用，对药物开发和靶标验证意义重大。

图3  邻近标记技术的应用（来源：Yang et al., 2020）

5. 技术优势

高时空分辨率和灵敏度：与Co-IP等技术相比，能够捕捉瞬时或弱亲和力的蛋白质相互作用。

细胞内研究：可在活细胞或组织中进行，能够反映蛋白质在生理环境中的真实相互作用和分布情况。

结合质谱分析：与质谱技术相结合，可同时鉴定大量的蛋白质相互作用伙伴，提供丰富的信息。

6.经典案例

案例一 

2025年2月，上海科技大学生命科学与技术学院李磊团队在研究论文《Heat-shock chaperone HSPB1 mitigates poly-glycine-induced neurodegeneration via restoration of autophagic flux》中，利用TurboID邻近标记技术分析poly-G聚集体的成分及其潜在相互作用伙伴，发现56种蛋白质在可溶性部分被标记，而不溶性组分中poly-G聚集体的成分经分析涉及多种细胞功能，最终鉴定出鉴定出自噬受体SQSTM1和TOLLIP（Ding et al., 2025）。

图4 文中PL邻近标记实验结果（来自原文Fig.3）

案例二 

2025年4月，天津医科大学张锴团队在研究论文《SIRT3 functions as an eraser of histone H3K9 lactylation to modulate transcription for inhibiting the progression of esophageal cancer》中，通过TurboID邻近标记技术鉴定了组蛋白H3K9la在细胞核内相互作用蛋白，结果发现SIRT3等一组蛋白可以与之互作，并最终确定SIRT3是组蛋白H3K9la的主要结合蛋白（Chen et al., 2025）。

图5  文中PL邻近标记实验结果（来自原文Fig.1）

07.相关技术服务

08.参考文献

[1] Choi-Rhee E, Schulman H, Cronan JE. Promiscuous protein biotinylation by Escherichia coli biotin protein ligase. Protein Sci. 2004 Nov;13(11):3043-50. 

[2] Yang X, Wen Z, Zhang D, Li Z, Li D, Nagalakshmi U, Dinesh-Kumar SP, Zhang Y. Proximity labeling: an emerging tool for probing in planta molecular interactions. Plant Commun. 2020 Dec 15;2(2):100137. 

[3] Qin W, Cho KF, Cavanagh PE, Ting AY. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nat Methods. 2021 Feb;18(2):133-143. 

[4] Knecht S, Eberl HC, Kreisz N, Ugwu UJ, Starikova T, Kuster B, Wilhelm S. An Introduction to Analytical Challenges, Approaches, and Applications in Mass Spectrometry-Based Secretomics. Mol Cell Proteomics. 2023 Sep;22(9):100636.

[5] Liu X, Abad L, Chatterjee L, Cristea IM, Varjosalo M. Mapping protein-protein interactions by mass spectrometry. Mass Spectrom Rev. 2024 May 14:10.1002/mas.21887. 

[6] Ding N, Song Y, Zhang Y, Yu W, Li X, Li W, Li L. Heat-shock chaperone HSPB1 mitigates poly-glycine-induced neurodegeneration via restoration of autophagic flux. Autophagy. 2025 Feb 25:1-18. 

[7] Chen C, Zhang Y, Zang Y, Fan Z, Han Y, Bai X, Wang A, Zhang J, Wang J, Zhang K. SIRT3 functions as an eraser of histone H3K9 lactylation to modulate transcription for inhibiting the progression of esophageal cancer. Mol Cell Proteomics. 2025 Apr 17:100973.