酵母核体系双杂交（Y2H）验证实验
1.介绍
酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）技术是一种经典的蛋白-蛋白相互作用（PPI）检测方法，被广泛应用于功能基因组学、信号转导通路解析及药物靶点筛选等研究领域。我们基于pGADT7和pGBKT7载体系统，提供专业的Y2H验证实验服务，适用于高校、研究所和生物医药企业的科研需求。团队拥有丰富的Y2H实验经验，依托高效的Y2H-Gold、AH109等酵母宿主菌株和标准化的操作流程，确保实验结果的可靠性和可重复性。
2.Y2H验证实验原理
1989年，Fields和Song发明了酵母双杂交（Y2H）测定法，开创了通过非生化手段研究蛋白质-蛋白质相互作用的新时代。其核心原理是利用转录因子（TF）的模块化特性，将待测蛋白分别融合至DNA结合结构域（DBD）和转录激活结构域（TAD）。若两者相互作用，则DBD和TAD被重新结合，恢复TF活性，驱动报告基因表达。通过检测报告基因的表达情况，即可判断蛋白-蛋白互作是否发生。
图1. Y2H技术原理（数据来源Lin, JS., Lai, EM. Methods in Molecular Biology. 2024）
酵母核体系双杂交（Y2H）验证技术原理：如上（图1），基于GAL4转录因子模块化特性，其DNA结合域（BD）和激活域（AD）可在酵母细胞内通过蛋白-蛋白相互作用重建转录激活功能，从而驱动报告基因（如ADE2、HIS3、LacZ等）的表达，实现阳性筛选。
核体系Y2H验证过程：为研究两个蛋白之间的相互作用，将目标蛋白A（Bait）融合到GAL4 DNA结合域（BD）上，构建pGBKT7诱饵载体。同时，将目标蛋白B（Prey）融合到GAL4激活域（AD）上，构建pGADT7猎物载体。随后，将pGBKT7-蛋白A和pGADT7-蛋白B共转化至Y2H-Gold（或AH109）酵母宿主细胞，并在SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade培养基上进行筛选。同时进行α-半乳糖苷酶（X-α-Gal）显色检测。如果酵母菌株生长且显蓝色，则表明蛋白A和蛋白B存在互作。
3.酵母核体系Y2H验证流程：
4. 酵母核体系Y2H验证蛋白样品种类：
5.Y2H实验转化方法
PEG/LiAc法：采用PEG 3350与醋酸锂处理，提高DNA摄取效率，使重组质粒进入酵母细胞。
电转化法（适用于高效转化需求）：利用电场促进DNA穿透酵母细胞壁，提高共转化效率。
6.Y2H蛋白互作实验典型案例
6.1 人畜共患寄生虫（Strongyloides stercoralis）中内切核酸酶Nob1的同源蛋白Ss-nopb-1的及其伴侣蛋白NOBP-1相互作用。
6.2 真核生物转录起始因子BjeIF2Bβ与芜菁花叶病毒m6A去甲基化因子BjALKBH9B相互作用。
参考文献
[1] Fields S, Song O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 1989 Jul 20;340(6230):245-6.
[2] Zhou H, Yuan W, Lei W, Zhou T, Qin P, Zhang B, Hu M. Domain definition and preliminary functional exploration of the endonuclease NOBP-1 in Strongyloides stercoralis. Parasit Vectors. 2023 Nov 3;16(1):399.
[3] Sha T, Li Z, Xu S, Su T, Shopan J, Jin X, Deng Y, Lyu X, Hu Z, Zhang M, Yang J. eIF2Bβ confers resistance to Turnip mosaic virus by recruiting ALKBH9B to modify viral RNA methylation. Plant Biotechnol J. 2024 Nov;22(11):3205-3217.