药物与膜蛋白互作：结构生物学+MST微量热泳动+分子动力学模拟揭小分子干扰SLC19A2/A3蛋白转运机制

创新型开发稳定肽，攻克SLC19A2/A3结构解析难题，实现高分辨率结构解析，精确捕获维生素结合口袋的结构特征，为阐明底物识别机制提供关键结构信息。

基于微量热泳动技术（MST）测定菲卓替尼和二甲双胍等药物与eGFP-靶蛋白融合蛋白的亲和力，证实其可通过竞争性结合机制占据底物结合位点的作用模式。采用GFP融合蛋白进行MST检测，可以直接采用细胞裂解液或者进行简单纯化就可以做MST检测，降低蛋白表达纯化难度。

通过分子动力学模拟系统研究靶蛋白-底物/抑制剂复合物的动态构象特征，验证复合物结合的稳定性，从动态相互作用角度支持冷冻电镜与MST亲和力测定数据的生物学一致性。

MST(MicroScale Thermophoresis，MST)采用微量热泳动原理，基于蛋白结合配体后构象、水化层和大小改变导致分子在温度梯度场中泳动速度的变化进行亲和力检测。将靶蛋白(Target)进行荧光标记，再将配体分子梯度稀释，靶蛋白与稀释后的配体共孵育后进行MST检测，从而检测靶蛋白与配体之间的亲和力KD值。本文通过构建膜蛋白-GFP融合蛋白的策略，成功解决了膜蛋白难以表达纯化而不能做分子互作实验的难题。

分子对接技术（molecular docking）：通过计算机计算出药物与蛋白结合的最佳的空间结合构象；能量匹配则是分子间保持稳定结合的基础，通过对受体与配体复合物间的弱相互作用(包括氢键、范德华力、π-π相互作用等)进行计算，找到受体与配体形成的复合物结合能最低，也就是最稳定的构象。

分子动力学模拟技术（Molecular Dynamics Similation）：模拟配体和受体的结合模式，研究分子识别的机制，评估配体和受体的亲和力。

这项研究中由于SLC19A3缺乏可辨别的膜外结构，研究者构建了缺乏无序结构的SLC19A3突变体（6-472），为帮助确定SLC19A3的结构，研究者通过在SLC19A3的N端第一个螺旋的N端添加理性设计的螺旋MPEP肽，添加该MPEP肽后SLC19A3-MPEP复合物能与MPEP肽的抗体特异性结合，从而形成SLC19A3-Fab复合物，辅助SLC19A3的结构解析工作，成功地确定了SLC 19 A3-Fab在与硫胺素、吡哆醇、菲卓替尼、氨丙沙星和二甲双胍复合时的冷冻电镜结构（图1）。

在SLC19A3与硫胺素（维生素B1），吡哆醇（维生素B6），二甲双胍，菲卓替尼、氨丙沙星等的复合物中，SLC19A3的NTD的（N端跨膜螺旋）和CTD（C端跨膜螺旋）通过一个长的细胞内连接到一起，在这个转运蛋白开口朝内（细胞内部）和开口朝外的结构中，都能明显地看到硫胺素非常契合地嵌入到结合口袋中央，并与邻近氨基酸形成广泛互作（图2a-b）。

进一步探究SLC19A2/A3转运体对底物的pH依赖性选择机制，研究设计了跨pH梯度的分子模拟实验。动力学模拟表明：在pH 6.0条件下，SLC19A2/A3与硫胺素在外向开放构象（outward-open）中的结合自由能显著低于pH 7.0环境，这与硫胺素在酸性微环境中的高效转运特性相吻合。有趣的是，吡哆醇与转运体的结合呈现相反趋势，其在pH 7.0时表现出更优的结合自由能，提示SLC19A2/A3通过pH敏感的构象门控机制实现底物选择性（图3c）。

为验证SLC19A2/A3对底物的pH依赖性结合特性，研究团队通过微量热泳动（MST）技术开展了系统性实验。实验采用分子筛层析纯化的eGFP标记的全长SLC19A2/A3膜蛋白（终浓度40 nM），分别与梯度稀释的硫胺素/吡哆醇（16个浓度梯度，nM-μM范围）在pH 7.5和pH 6.0缓冲体系中按体积比1：1孵育10分钟后进行检测。定量分析显示：在pH 7.5条件下，SLC19A2和SLC19A3与硫胺素的平衡解离常数KD分别为78.4 μM和153.7 μM；当pH降至6.0时，两者与硫胺素的亲和力显著增强，KD值分别提升至1.2 μM和0.25 μM（图4a），与分子动力学模拟预测的pH依赖趋势高度一致。

进一步实验发现，SLC19A2/A3与临床药物分子（氨丙啉、菲卓替尼、二甲双胍）的亲和力显著高于内源性底物（图4b,c）。结合冷冻电镜结构与分子动力学轨迹分析，证实上述药物通过竞争性占据硫胺素/吡哆醇的结合口袋，形成更稳定的复合物。这种空间位阻效应从原子层面解释了药物使用中维生素B1/B6（硫胺素/吡哆醇）缺乏的副作用机制，为临床药物优化提供了关键分子依据。

图4 MST检测膜蛋白SLC19A2/A3与底物的结合

MST

Binding of SLC19A2 and SLC19A3 to thiamine, pyridoxine, fedratinib, erythromycin, thiamine pyrophosphate, metformin, amprolium were measured by MST experiment. The eGFP-tagged fulllength SLC19A2 and SLC19A3 were purified by size exclusion chromatography in the assay buffer (50 mM MES pH 6.0,150 mM NaCl, 0.01% DDM, 0.001% CHS). Peak fractions were pooled and diluted to 40 nM. Ligand stocks (250 mM thiamine, 200 mM pyridoxine, 125 mM fedratinib, 100 mM erythromycin, 90 mM thiamine pyrophosphate, 200 mM metformin, 600 mM amprolium) were diluted to a suitable concentration used in the assay buffer. For MST measurements, a series of 16 sequential 1:1 dilutions were prepared using assay buffer for each ligand, and each ligand dilution was mixed 1:1 with diluted protein to final protein concentration of 20 nM and final ligand concentrations in the μM to nM range. The samples were incubated for 10 min at room temperature, and then loaded into Standard Monolith Capillaries (Cat# MO-K022, NanoTemper Technologies). Measurements were carried out with a Monolith NT.115 device at 80% LED power and 40% MST power. Kd was determined using the MO. Affinity Analysis software (version 2.3, NanoTemper Technologies, Germany) is with the Kd fit function. Capillaries displaying aggregation or adsorption were excluded. Data of at least three independently pipetted measurements were analyzed and Kd is expressed as mean ± SEM. Binding curves were plotted by GraphPad Prism Prism 9.5.1 (GraphPad Software Inc., San Diego, USA).