MST微量热泳动技术分享：用于验证蛋白与蛋白结合的关键氨基酸位点

在受体-配体蛋白相互作用机制研究中，精准解析结合界面的结构域与关键氨基酸残基是阐明信号通路调控原理、指导治疗靶点开发的核心环节。近年来，研究者多技术联用的策略实现这一目标：

为解析MERTK与Feimin相互作用的关键结构域，研究者构建了MERTK系列缺失突变体（Mut1-5，缺失了不同结构域中的部分氨基酸），并通过GST-pull down实验系统筛选其结合能力。结果显示，GST-Feimin能与Mut1-4的MERTK突变体结合，而缺失FNIII结构域部分氨基酸的Mut5突变体则完全丧失结合能力（图2A），由此明确FNIII结构域是介导二者相互作用的核心区域。

为进一步验证结合位点的特异性，研究团队基于MERTK与家族成员TYRO3、AXL的序列差异，通过同源序列比对筛选出8个保守的酸性氨基酸位点（D/E，带负电），并将其全部突变为精氨酸（R，带正电）(E396R, D402R, D414R, E416R, E434R, E437R, E438R, D474R，8个氨基酸在MERTK家族TYRO、AXL中保守，全部是D或E，全部突变为R，能破坏可能与Feimin形成的盐桥键相互作用)（图2B,C）。MST实验显示，该8位点突变体与Feimin的亲和力显著降低（KD = 99.19 ± 5.81 nM），较野生型亲和力下降约5倍（图1A），提示这些酸性氨基酸残基对Feimin结合MERTK具有关键作用。为排除突变对受体MERTK整体构象的影响，研究者平行检测了8位点突变体与其经典配体GAS6的结合能力。结果显示，野生型MERTK（KD = 48.82 ± 5.45 nM）与8位点突变体（KD = 49.71 ± 4.86 nM）对GAS6的亲和力无统计学差异（图1C），证实MERTK突变仅特异性影响Feimin结合位点，而受体其他功能域保持完整。这些研究表明了MERTK是Feimin的受体蛋白，并且MERTK的FNIII结构域是其参与Feimin结合的关键结构域。

图2 筛选构建MERTK突变体

基于Feimin-MERTK信号通路在调控餐后血糖中的关键作用，研究者进一分析了人类MERTK的Feimin结合区域（即FNIII结构域）单核苷酸多态性(SNP)，发现携带MERTK R466K突变的个体（包括非糖尿病和糖尿病个体）均表现出餐后血糖水平升高，提示该突变可能与Feimin-MERTK信号通路受损相关。为确定R466K突变的功能影响，研究者通过MST微量热泳动评估了突变体与Feimin的亲和力，结果显示，野生型MERTK与Feimin的解离平衡常数KD=12.74±0.90nM，而R466K突变体的解离平衡常数KD升高至45.60±2.05 nM，表明该突变导致Feimin与MERTK结合力降低（图3A）。从而说明MERTK的FNIII结构域中关键R446K突变降低了与Feimin的结合能力，损害其下游血糖调控功能（导致了餐后血糖水平升高）（图3B）。

图3 Feimin与MERTK R466K突变体亲和力测定

MST实验方法

The MST assay was performed as previously described. The affinity of purified ligands for receptors was measured using a Monolith NT.115 (NanoTemper Technologies). Receptors were fluorescently labelled according to the manufacturer’s protocol, and approximately 20 nM labelled protein was used for each assay. A solution of unlabelled ligands was diluted to create an appropriate serial concentration gradient. The samples were loaded into NanoTemper glass capillaries following incubation at room temperature for ~30–60 min. Measurements were carried out using 20–100% light-emitting diode power and medium MST power. Assays were repeated three times for each affinity measurement. Kd values were calculated using the mass action equation in NanoTemper Analysis software (MO.Affinity Analysis (x86)). The overlay diagram was created by normalization of data to fraction bound.

Shi, X.; Hu, X.; Fang, X.; Jia, L.; Wei, F.; Peng, Y.; Liu, M.; Gao, A.; Zhao, K.; Chen, F.; Hu, X.; Hong, J.; Ning, G.; Song, Y.; Wang, J.; Wang, Y. A Feeding-Induced Myokine Modulates Glucose Homeostasis. Nature Metabolism, 2025, 7, 68–83. https://doi.org/10.1038/s42255-024-01175-9.