MST微量热泳动技术分享：一文读懂多元互作分析（Nature）

微量热泳动技术介绍

MST(MicroScale Thermophoresis)技术基本原理：

溶液中的分子在温度梯度场中定向从高温区向低温区移动，不同分子由于其尺寸、水化层和电荷等物理化学性质的差异，其热泳动速率也各不相同。

采用MST技术检测分子间相互作用的基本原理：检测时将互作中的一个分子进行荧光标记，在MST技术中称之为Target；与之互作的另一个分子称之为Ligand。Target分子与Ligand分子结合形成复合物，复合物分子的尺寸、水化层和电荷等性质相对于Target分子的改变都可以导致复合物分子的热泳动速度相对于Target分子的热泳动速度变快或者变慢。

进行MST实验时将Ligand分子按照2倍的浓度梯度稀释配制16管溶液，然后和Target分子等体积混合，吸入毛细管后放入仪器中进行检测(图1B)。检测时仪器中的红外激光束对毛细管的检测区域正中心进行加热(图1B)，激光束周围的溶液形成温度梯度场，分子在温度梯度溶液中由高温区域向低温区域定向移动，并且移动速度和分子的尺寸大小、水化层及电荷有关。

激发光激发Target分子上的荧光基团，通过发射光检测器记录温度梯度场中Target分子发出的荧光强度变化情况(图1C)，图1.C中的横坐标为时间，纵坐标为荧光强度，红色曲线为MST-Trace。图1.D左图中每一条曲线是一根毛细管中的荧光强度实时记录曲线（MST-Trace），记录了温度梯度场中荧光强度随时间的变化。然后将荧光强度的数值做纵坐标，配体浓度做横坐标进行拟合作图，软件自动计算得到该结合的亲和常数K_D。

图1 微量热泳动技术原理

以A、B两种分子、C化合物三种不同分子进行多元互作分析为例。

实验组：一般将A分子作为Target分子 (标记荧光) 与固定浓度的C分子混匀，再将B分子进行2倍梯度稀释后，与等体积的A分子和C分子混合物混匀孵育后进行MST检测，即开展 B 分子与 A-C 混合体系的MST实验。

图2 MST技术测定多个分子间的亲和力

案例：MST用于多元互作亲和力测定

2025年，发表在《Nature》一篇题为“UM171 glues asymmetric CRL3–HDAC1 /2 assembly to degrade CoREST corepressors”的研究论文。揭示了小分子药物UM171作为分子胶，能够不对称地诱导CRL3 E3泛素连接酶底物适配器(substrate adapter) KBTBD4二聚体与HDAC1/2的相互作用，进而促进转录共抑制因子CoREST的降解。

本研究中，作者通过微量热泳动（Microscale Thermophoresis, MST）实验结果发现，UM171能够显著增强KBTBD4与LHC（LSD1-HDAC1-CoREST）复合物之间的相互作用。

具体来说，MST实验测量了在有无UM171存在的情况下，KBTBD4与LHC之间的结合亲和力（K_D值）。

MST结果证明：在存在UM171（50 µM）时，KBTBD4与LHC复合物之间的结合能力显著高于没有UM171时的结合能力(图3)。这一结果表明，UM171作为一种分子胶，能够显著增强KBTBD4与LHC之间的结合亲和力，从而促进复合物的形成。这种增强的结合亲和力对于UM171诱导的蛋白质降解机制至关重要，因为它有助于稳定KBTBD4与LHC复合物之间的相互作用，进而促进LHC复合物的泛素化和降解。

Microscale thermophoresis measurements

MST assays were performed with the Monolith NT.115 (NanoTemper) system using the Nano BLUE mode. The exciting laser power was set at 50% and MST power was set to medium. KD values were calculated using MO.analysis (v.2.3) software with the quadratic equation binding KD model shown below:

Titration of KBTBD4. Fluorescein-labelled LHC (200 nM) was titrated with WT KBTBD4 in the absence or presence of DMSO or UM171 (50 µM) in the MST-binding assays at 23 °C. WT KBTBD4 (up to 11.7 µM) was prepared with a twofold serial dilution for titrating with fluorescein–LHC. Then, 50 µM UM171 or an equivalent amount of DMSO were added. LHC (or LSD1–CoREST) at a final concentration of 200 nM was then added, mixed well and incubated for 10 min for equilibration before transferring to MST premium capillaries. Prism 9 was used to fit the data to a four-parameter dose–response curve.

参考文献

[1] Yeo M J R, Zhang O, Xie X w, et al. UM171 glues asymmetric CRL3–HDAC1/2 assembly to degrade CoREST corepressors[J]. Nature, 2025: 1-9.