药物与蛋白互作：TPP热蛋白质组学+SPR+MST+ITC+CETSA+计算模拟揭示PF403作用靶点

通过热蛋白质组分析（TPP）技术，系统性捕获药物结合后热稳定性显著变化的蛋白，绘制靶点“藏宝图”，缩小潜在作用靶标范围。

借助SPR表面等离子共振、MST微量热泳动等技术定量检测药物分子与靶点的结合强度（KD）与动力学参数，如同“分子测谎仪”，直接验证互作真实性。

分子对接与动力学模拟构建“数字战场”，动态解析药物-靶点的结合模式、关键残基及构象变化，预测机制并指导理性设计。

热蛋白质组分析技术

TPP利用蛋白质在加热过程中变性沉淀的特性，当蛋白质与配体（如小分子化合物、中药单体或代谢物）结合时，其热稳定性会发生变化（Tm值改变）。通过加热样本，未结合的蛋白质变性沉淀，而结合的蛋白质因稳定性增强仍保持可溶状态。结合蛋白组质谱技术，检测不同温度下可溶性蛋白质的丰度变化，从而检测到能与配体结合的蛋白。

SPR基于表面等离子体共振现象，当固定于传感芯片上的配体（如蛋白）与溶液中的分析物（如药物）结合或解离时，芯片表面物质质量的改变导致芯片背面上的反射光的共振角发生偏移；通过实时监测这一角度变化，可无标记、动态检测分子间的结合/解离过程，并精确计算亲和力（KD）及动力学参数（ka/kd），广泛应用于药物筛选及分子互作研究。

CETSA-WB的核心原理基于小分子-靶蛋白相互作用引发的热稳定性改变。当药物分子与靶蛋白特异性结合时，可通过构象调节作用增强或削弱其热力学稳定性。实验通过温度梯度诱导蛋白质变性（变性沉淀）：将样本在预设温度加热后，未与药物结合的游离蛋白会在临界变性温度下聚集沉淀，而小分子-靶蛋白复合物因稳定性变化表现出不同的抗变性能力。通过离心分离沉淀与上清组分，利用Western blot等检测手段对可溶性靶蛋白进行定量分析，通过比较处理组与对照组的蛋白稳定性差异，定性检测小分子与靶蛋白的结合。

MST采用微量热泳动原理，基于蛋白结合配体后构象、水化层和大小改变导致分子在温度梯度场中泳动速度的变化进行亲和力检测。将靶蛋白(Target)进行荧光标记，再将配体分子梯度稀释，靶蛋白与稀释后的配体共孵育后进行 MST 检测，从而检测靶蛋白与配体之间的亲和力。

等温滴定量热法（ITC）基于分子结合时吸热或者放热现象进行生物分子间亲和力检测。样品池中加入被滴定物（如蛋白质），滴定针中加入滴定物（如药物）。每次滴定产生热量脉冲，通过积分和浓度归一化处理，生成摩尔放热量（kcal/mol）对摩尔比率（被滴定物/滴定物）的曲线。选择合适结合模型拟合后，可获得亲和力（KD）、化学计量比（n）、焓变（ΔH）和熵变（ΔS）。

微量差示扫描荧光技术(nanoDSF)利用仪器在升温过程蛋白中色氨酸和酪氨酸的自发荧光变化检测蛋白质的稳定性。随着升温蛋白质发生变性,折叠在蛋白质内部的色氨酸和酪氨酸暴露在亲水环境中导致自发荧光的改变，仪器同步采集350nm和330nm自发荧光，通过350nm和330nm自发荧光的比值自动拟合出蛋白的热变性曲线从而得到蛋白质的Tm 值。根据化合物与靶蛋白结合后的Tm值得改变，定性判断出化合物与靶蛋白的结合。

分子对接技术：通过计算机计算出药物与蛋白结合的最佳的空间结合构象；能量匹配则是分子间保持稳定结合的基础，通过对受体与配体复合物间的弱相互作用(包括氢键、范德华力、π-π相互作用等)进行计算，找到受体与配体形成的复合物结合能最低，也就是最稳定的构象。

分子动力学模拟技术：模拟配体和受体的结合模式，研究分子识别的机制，评估配体和受体的亲和力。

2025年2月中国医学科学院北京协和医院药物研究所在APSB（IF=14.8，中科院一区top）上发表题为“Thermal proteome profiling (TPP) reveals NAMPT as the anti-glioma target of phenanthroindolizidine alkaloid PF403”的研究论文。该研究采用热蛋白质组分析（TPP）技术以PF403为“探针”筛选到靶点蛋白NAMPT。结合分子互作手段（CETSA细胞热迁移、MST微量热泳动、SPR表面等离子体共振和等温滴定量热法（ITC））确认了PF403与NAMPT蛋白之间的高亲和力结合。最终，通过蛋白结构分析与计算模拟相结合，结合NanoDSF和MST亲和力测定，揭示NAMPT蛋白的Y188氨基酸是参与PF403结合的关键氨基酸，上演了一场“蛋白质组学+分子互作+计算模拟”的高效组合拳，直击靶点发现核心难题。

然后进行蛋白质提取、肽段标记和分离：通过反复冻融法裂解细胞，离心获取蛋白上清液；获取蛋白样品在37℃条件下进行胰酶（Trypsin）酶解16小时，生成肽段混合物。使用TMT10等量标记试剂对10个温度点的肽段进行同位素标记，每个温度点设置18个生物学重复；标记后肽段经超高效液相色谱（UPLC）系统进行预分离，降低样本复杂度。

最后质谱检测与数据分析：分离后的肽段通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行深度分析；原始数据经Proteome Discoverer 2.5软件进行数据库搜索与定量分析；通过非线性拟合获得各蛋白的温度-丰度曲线，评估热稳定性变化。

最后，研究者鉴定到NAMPT与PF403呈现强互作关系，并推测NAMPT蛋白可能是PF403的靶点蛋白（图1）。

为进一步确认结合特异性，研究人员采用微量热泳动技术（MST）。通过NHS荧光标记试剂盒对NAMPT蛋白进行标记，并将蛋白稀释至40 nmol/L工作浓度后，与梯度浓度（溶解于5%DMSO）的PF403共孵育。MST检测数据表明，PF403与NAMPT蛋白存在直接相互作用，并测得平衡解离常数KD为2.69 μmol/L（图2B）。

为精确解析结合动力学参数，研究团队进一步利用表面等离子体共振技术（SPR）。将NAMPT蛋白以氨基偶联法固定于CM7传感芯片，以梯度浓度的PF403作为流动相进行结合-解离分析。基于1:1 Langmuir结合模型拟合动力学曲线，计算得到KD值为2.63 μmol/L（图2C），与MST结果高度一致。

最后，通过等温滴定量热法（ITC）验证结合亲和力。实验设计中将PF403（滴定物）逐步注入含NAMPT蛋白（底物）的样品池中，实时监测热量变化。ITC测得KD值为3.35 μmol/L（图2D）。综上，CETSA、MST、SPR和ITC四项互补技术均证实PF403能够直接结合NAMPT蛋白，且各技术测得的平衡解离常数（2.63–3.35 μmol/L）高度吻合，为PF403通过靶向NAMPT发挥功能提供了多重实验证据。

CETSA实验方法

For the living cell CETSA experiment, cells were treated with or without PF403 (10 μmol/L) for 3 h. The cells were collected and equally divided into 12 parts with 0.2% NP40-PBS solution, heated at specific temperatures (37–72 °C), and then cooled for 3 min. The samples were lysed by freeze–thawing three times with liquid nitrogen. After ultracentrifugation, the supernatant was subjected to a WB assay. In addition, for the cell lysate and recombinant NAMPT CETSA experiments, the samples were divided into two parts and treated with or without PF403 (10 μmol/L) for 1.5 h at 25 °C. Subsequent manipulation was consistent with the above procedure except that the cells were not lysed. For concentration-dependent CETSAs, the samples (live cells, lysate, recombinant NAMPT) were divided into 10 parts. Subsequently, the 10 parts were treated with vehicle control or (2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 300, or 500 μmol/L) PF403, followed by heating for 3 min and cooling for 3 min. Then, high-speed   centrifugation was performed to collect the supernatant for the WB assay.

MST实验方法

Recombinant NAMPT was labeled with a Monolith Protein Labeling Kit (red-NHS 2nd Generation Kit). Subsequent pretest experiments were performed to test the labeling effect. Recombinant NAMPT was diluted to a working concentration of 40 nmol/L using an assay buffer. Small molecules are soluble in DMSO, and the DMSO content of the protein–ligand mixed solution must be less than 5%. Subsequently, a Monolith NT.115 (NanoTemper, Munich, Germany) was used for thermophoresis measurements.

SPR实验方法

The interaction between the recombinant proteins NAMPT and PF403 was quantified using a Biacore 1K (Cytiva, Sweden) with a CM7 sensor chip. The 300 mmol/L concentration of buffer salts and 0.1% BSA were used to reduce the non-specific binding on the chip. The amine coupling method was applied to immobilize recombinant NAMPT on the Sencor chip. NAMPT coupling was performed at a concentration of approximately 27.5 μg/mL in a pH 5.0 sodium acetate solution, with a chip activation time of 420 s and a closure time of 420 s. Small molecules were solubilized with 5% DMSO, and PBST was used as the running buffer. Biacore Insight Evaluation (5.0.18.22102) was used to calculate the kinetic parameters of Kd.

ITC实验方法

The ITC experiment was performed on the nanoITC (TA-USA). PF403 was solubilized in PBS buffer with 2% DMSO, and the protein solution was replaced with the same buffer. The stirring speed was set to 300 rpm (nanoITC, TA Instruments, New Castle, DE, USA), and the titration interval was 150 s/15 drops at 25 °C. Raw data were analyzed with NanoAnalyze DataAnalysis (version 3.12.5).

为探究NAMPT与PF403相互作用的关键氨基酸，研究者通过X射线衍射技术获得了NAMPT与PF403的复合物晶体结构（图3A），采用分子对接软件薛定谔进行结构分析表明，在NAMPT-PF403的共晶中，NAMPT的Y188和Y191与PF403形成了相互作用（图3B，C）。

为进一步分析NAMPT和PF403之间相互作用的关键氨基酸，研究者采用分子动力学模拟方法对NAMPT-PF403进行了200纳秒的分子动力学（MD）模拟，以检测小分子PF403在NAMPT结合口袋中的构象变化及互作氨基酸变化。计算结果显示，均方根偏差（RMSD）在60纳秒后达到稳定状态（图3D）。在整个模拟过程中，NAMPT蛋白与PF403形成主要相互作用的氨基酸为Y188和V350，其中Y188与结构分析中主要相互作用氨基酸相一致（图3E）。

为探究NAMPT参与互作的主要氨基酸，研究者结合动力学模拟结果和丙氨酸扫描分析，设计并进行了Y188A、H191A、D219A、V242A、S275A、I309A、R311A、V350A和I351A等突变体的构建。在表达这些突变蛋白后，采用NanoDSF技术检测突变体加入小分子PF403后的热稳定性变化，将蛋白质-小分子复合物共10 μL样品加入样品架后，设置温度升高区间为20-95℃，1℃/min的速度升温。NanoDSF结果显示，Y188A突变体加入PF403共孵育后，其热稳定性未发生显著改变，提示Y188A突变体无法与PF403结合（图3F）。研究者进一步采用微量热泳动法（MST），采用red-NHS试剂盒标记Y188A突变体蛋白，并将重组的Y188A突变体稀释至40 nmol/L的工作浓度后与溶解于DMSO的小分子PF403共孵育，最后测得Y188A突变体完全丧失了与PF403的结合能力（图3G），这些结果证实Y188是参与PF403结合的关键氨基酸。

NanoDSF实验方法

Label-free nanoDSF technology operated by Prometheus NT.48 (NanoTemper, Munich, Germany) can accurately detect changes in endogenous fluorescence during thermal and chemical denaturation of proteins. Control proteins and protein–ligand complexes were pipetted into the sample rack with 8–10 μL of sample. The temperature increase interval was 20–95 °C, and the temperature increase rate was 1 °C/min.

分子对接

Docking studies were performed with the Glide module within the Schrödinger   package based on the united atom scoring function. The protein preparation wizard   was utilized to prepare the crystal structures of NAMPT. For the cocrystal structure of   the NAMPT–PF403 complex, we performed protein–ligand interaction analyses after   protein preparation in Maestro. Images elucidating the protein–ligand interactions   were produced by PyMOL (version 1.7.2.1).

分子动力学模拟方法

The protein–ligand complexes were subjected to MD simulation with Desmond. First,   the chosen complexes were embedded in a simple point charge water model after   processing with the Protein Preparation Wizard. An orthorhombic box with a 10 Å   radius was utilized to describe the core, and all the complexes were neutralized by   adding numerous Na+ and Cl– ions with the physiological salt concentration at 0.15   mol/L. Subsequently, the systems were subjected to a minimization job to relax with   the maximum number of interactions set to 2000 and the convergence threshold set to   1.0 kcal/mol/Å. Notably, the OPLS_3 force field was applied to the protein–ligand   systems, and the other parameters were set to their defaults. The minimized systems   were subjected to MD for a simulation time of 200 ns with a time step of 2 fs in an   NPT ensemble using a Nose-Hover thermostat at a temperature of 300 K and a   JournalPre-proof pressure of 1.01325 bar set by Martyna-Tobia-Klein barostats to relax the complex.   During the process of MD simulation, the energies were calculated every 1.2 ps, and   every trajectory was recorded with a time interval of 4.8 ps. Moreover, the RMSD,   root mean square fluctuation (RMSF), and intermolecular interactions were   monitored.

Li, F.; Zhang, Z.; Shi, Q.; Wang, R.; Ji, M.; Chen, X.; Li, Y.; Liu, Y.; Yu, S. Thermal Proteome Profiling (TPP) Reveals NAMPT as the Anti-Glioma Target of Phenanthroindolizidine Alkaloid PF403. Acta Pharmaceutica Sinica B, 2025. https://doi.org/10.1016/j.apsb.2025.02.027.