药物蛋白互作分享：SPR+MST+计算模拟揭示FXR拮抗剂Mebhydrolin作用靶点

通过SPR单浓度筛选技术在对化合物库进行“快速扫描”，筛选潜在候选化合物。

借助MST微量热泳动技术定量检测靶蛋白与候选化合物结合强度（KD），直接验证互作真实性。

动力学模拟绘制蛋白靶点与药物分子“密钥啮合”动态作战地图，动态解析药物-靶点结合模式，探寻药物-靶点互作机制。

SPR基于表面等离子体共振现象，当固定于传感芯片上的配体（如蛋白）与溶液中的分析物（如药物）结合或解离时，芯片表面物质质量的改变导致芯片背面上的反射光的共振角发生偏移；通过实时监测这一角度变化，可无标记、动态检测分子间的结合/解离过程，并精确计算亲和力（KD）及动力学参数（ka/kd），广泛应用于药物筛选及分子互作研究。

MST采用微量热泳动原理，基于蛋白结合配体后构象、水化层和大小改变导致分子在温度梯度场中泳动速度的变化进行亲和力检测。将靶蛋白(Target)进行荧光标记，再将配体分子梯度稀释，靶蛋白与稀释后的配体共孵育后进行MST检测，从而检测靶蛋白与配体之间的亲和力。

分子对接技术：通过计算机计算出药物与蛋白结合的最佳的空间结合构象；能量匹配则是分子间保持稳定结合的基础，通过对受体与配体复合物间的弱相互作用(包括氢键、范德华力、π-π相互作用等)进行计算，找到受体与配体形成的复合物结合能最低，也就是最稳定的构象。

分子动力学模拟技术：模拟配体和受体的结合模式，研究分子识别的机制，评估配体和受体的亲和力。

在本研究中，研究者采用氨基偶联法将纯化的His-hFXRα-LBD蛋白固定于生物传感器芯片表面，随后对的FDA批准药物单体进行单浓度进样高通量筛选。通过表面等离子体共振（SPR）技术，发现Mebhydrolin能够与FXR特异性结合。并使用SPR多浓度进样分析测定结合亲和力，然后研究者将Mebhydrolin（浓度梯度：2.5 μM、6.25 μM、12.5 μM、25 μM、40 μM、50 μM）溶解于PBST缓冲液中，以25 μL/min的流速注入芯片通道，随后进行2.5分钟的PBST缓冲液解离，最终证实FXR蛋白能够有效结合Mebhydrolin。

为精确测定FXR与Mebhydrolin的结合亲和力，研究者进一步采用微量热泳动（MST）技术进行验证。首先，将FXR蛋白用荧光染料标记，随后与不同浓度（0.3 nM-1 mM）的Mebhydrolin在室温下共孵育30分钟。使用Monolith NT.115仪器进行MST检测，通过分析热泳动曲线，计算出FXR与Mebhydrolin的平衡解离常数（KD）为9.87 μM。

这一结果与SPR筛选结果相互印证，证实了Mebhydrolin与FXR的特异性结合。

SPR实验方法

Purified His-hFXRα-LBD protein was immobilized on the carboxymethyl dextran chip (13206066; Reichert) by amino coupling reaction with final response at 5000 RU. Then, Mebhydrolin (2.5, 6.25, 12.5, 25, 40, 50 μM) diluted in PBST buffer were injected into the chip with a flow rate of 25 μl/min for 1.5 min and PBST buffer was injected with 2.5 min for dissociation. The equilibrium dissociation constant (KD) was calculated by Scrubber 2 software (Biologic Software, Australia) to determine the affinity of Mebhydrolin to FXR-LBD protein.

MST实验方法

His-FXR-LBD protein was labeled with primary-amine coupling of MO-LO18 dye (Nano Temper), followed by the addition of different concentrations of Mebhydrolin (0.03 nM to 1 mM). After incubation for 0.5 h, Microscale thermophoresis (MST) assay was performed at room temperature on a Monolith NT.115 instrument (Nano Temper) by the manufacturer's protocol. Data analysis was performed with Nano Temper Analysis software.

机制研究表明，Mebhydrolin通过特异性靶向FXR受体调控下游信号通路，从而维持血糖稳态。该作用机制在后续细胞实验中得到进一步验证。

基于分子动力学模拟结果，研究者对蛋白质-配体复合物进行了氨基酸残基自由能分解计算。通过分析各氨基酸残基对结合自由能的贡献率，系统筛选出参与配体相互作用的关键氨基酸位点。随后，采用丙氨酸扫描突变法（alanine scanning mutagenesis），将这些关键氨基酸逐一突变为丙氨酸，并计算突变前后的结合自由能变化。结果显示，L291A、M332A和Y373A三个突变体较野生型均表现出显著的结合自由能改变（图3G）。为验证这一发现，研究者进一步通过微量热泳动（MST）技术检测了上述突变体与Mebhydrolin的结合能力。实验结果表明，这三个突变体几乎完全丧失了与Mebhydrolin的结合能力，从而证实L291、M332和Y373是介导Mebhydrolin与FXR特异性结合的关键氨基酸残基（图3H）。

综合以上研究结果，我们揭示了Mebhydrolin通过稳定结合FXR配体结合口袋，诱导H2/H6螺旋构象改变，进而调控受体下游信号通路的分子机制。

分子动力学模拟方法

Protonation states of the ionizable residues were computed by using the PROPKA online server. Ligand parameters were generated with Antechamber in Amber 14. Molecular dynamics (MD) simulations were performed and analyzed with the Amber 14 package. All atom force field ff99SB was applied. Protein-ligand complexes were solvated by using the TIP3P water model. Counter ions were added to neutralize the systems. The systems were minimized with descending restraint forces. The temperature was slowly increased from 0 to 300 K under NVT ensemble conditions and equilibrated under NPT ensemble conditions for 500 ps at 300 K. 200 ns unrestrained MD production was performed for each system. The time step was set to 2 fs and the atom coordinates were saved every 10 ps for subsequent analysis.