以药找靶、药物与靶蛋白结合验证：ABPP+MST+分子动力学模拟揭示甲异靛治疗白血病的机制
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Advanced Science | 揭示蛋白激酶PKMYT1是治疗慢性髓性白血病药物甲异靛（Mei）的直接靶点
近期，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所庾石山团队在Advanced Science发表题为《Meisoindigo Acts as a Molecular Glue to Target PKMYT1 for Degradation in Chronic Myeloid Leukemia Therapy》研究论文，揭示蛋白激酶PKMYT1是甲异靛（Mei）治疗慢性髓性白血病（CML）的直接靶点。
研究证实，PKMYT1在 CML细胞生长中发挥关键作用，其在K562细胞中的敲低可导致细胞周期阻滞于G2/M期、诱导细胞凋亡并抑制增殖；在动物模型体内，PKMYT1 敲低能够显著延缓白血病进展、减少肿瘤转移并延长荷瘤小鼠生存期。
文章研究思路
主要研究内容
甲异靛（Meisoindigo，Mei）用于治疗慢性髓性白血病（CML）多年，但其作用靶点不明。本研究通过设计并合成带有炔基的Mei探针（MP），利用ABPP基于活性的蛋白质谱技术，发现蛋白激酶PKMYT1是Mei治疗CML的直接靶点。实验结果显示，MP在细胞毒性实验中与Mei具有相当的活性；共聚焦显微镜观察确认了MP对K562细胞的有效标记，且加入Mei可降低标记强度，表明两者具有共同的靶点结合特性。通过荧光标记（图1.i）和定量蛋白质组学分析（图1.e.f.g.h），研究团队从MP标记的蛋白质中筛选出7个潜在靶点，其中PKMYT1和ERG1的分子量与实验结果相符。
图1 通过ABPP鉴定Mei的潜在靶点（来自原文Fig.1）
进一步的体外实验表明，Mei与PKMYT1具有浓度依赖性的结合能力，CETSA细胞热迁移（图2.c）和MST微量热泳动（图2.e）实验均证实了Mei与PKMYT1的直接相互作用。在功能验证方面，通过CRISPR-Cas9技术敲低K562细胞中的PKMYT1后，细胞增殖被显著抑制，且Mei的抗肿瘤效果被削弱。体内异种移植模型实验也表明，敲低PKMYT1显著抑制了肿瘤生长，同时Mei对PKMYT1敲低肿瘤的抑制效果减弱，进一步证实了PKMYT1在Mei抗肿瘤机制中的关键作用。
图2 验证PKMYT1为Mei的直接靶点（来自原文Fig.2）
此外，研究还发现Mei的α,β-不饱和酮结构能够与PKMYT1中的半胱氨酸（Cys）巯基形成共价键，这一特性是Mei发挥细胞毒性和降解PKMYT1的关键。通过突变分析和分子动力学模拟，确认了Mei与PKMYT1的Cys301残基具有特异性结合。此外，Mei与Cys的反应是可逆的，其与PKMYT1的结合也表现出可逆性。
图3 验证Mei对PKMYT1可逆共价修饰（来自原文Fig.3）
进一步研究发现，Mei通过促进PKMYT1的泛素化降解来降低其蛋白水平。蛋白酶体抑制剂MG-132能够阻断Mei诱导的PKMYT1降解，而溶酶体抑制剂Baf-A1则无此效果，表明PKMYT1主要通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）降解。
CoIP实验表明，Mei诱导的PKMYT1多聚泛素化主要依赖于K48连接的泛素链。通过分析PKMYT1的相互作用组和E3泛素连接酶库，研究团队鉴定出TRIM25是Mei诱导PKMYT1降解的关键E3连接酶。Mei显著增强了PKMYT1与TRIM25的结合，且TRIM25的敲低部分抑制了Mei诱导的PKMYT1降解。
MST微量热泳动实验进一步证实了Mei能够显著增强PKMYT1与TRIM25之间的结合亲和力（图3.e.f）。此外，活细胞荧光成像实验表明，Mei能够促进PKMYT1、Mei和TRIM25三元复合物的形成。
然而，当PKMYT1的Cys301残基发生突变时，Mei无法增强PKMYT1与TRIM25的结合，也无法促进PKMYT1的泛素化。这些结果表明，Mei作为一种分子胶，通过与PKMYT1的Cys301残基共价结合，促进PKMYT1与TRIM25复合物的形成，进而导致PKMYT1的泛素化和蛋白酶体降解。
图4 Mei通过增强PKMYT1与TRIM25的相互作用促进PKMYT1降解（来自原文Fig.5）
临床相关性研究发现，PKMYT1在CML患者中的mRNA水平显著高于健康对照，且与细胞周期调控基因密切相关。功能表型分析显示，PKMYT1敲低可阻滞K562细胞于G2/M期，抑制其增殖和集落形成，增加活性氧（ROS）水平并诱导凋亡，也妨碍了线粒体功能。体内实验表明，PKMYT1敲低后显著延缓白血病进展，延长小鼠生存时间，减少远处转移和白血病细胞比例，降低CD34+白血病干细胞丰度。这些结果证实了PKMYT1在CML中的关键作用及其作为治疗靶点的潜力。
图5 敲低PKMYT1延缓CML进展并抑制白血病细胞转移（来自原文Fig.7）
小佰说
这项研究发现，药物Mei作为一种分子胶粘剂，可以靶向蛋白激酶PKMYT1，在CML治疗中促进其降解。通过ABPP分析，筛选出了PKMYT1，并通过MST和CETSA确定其为Mei的直接靶标。Mei与PKMYT1的Cys301残基形成选择性和可逆的共价键，触发其K48连接的聚泛素化并加速其通过E3连接酶TRIM25介导的蛋白酶体降解。Mei通过增强PKMYT1与TRIM25的相互作用，促进PKMYT1的有效降解。敲低CML细胞中的PKMYT1诱导G2/M期细胞周期阻滞，增强凋亡，并抑制增殖。在体内异种移植模型中，PKMYT1敲低延缓白血病进展并减少转移，强化了其在CML进展中的作用。
技术简介
1.
微量热泳动
MST
MST（MicroScale Thermophoresis）是通过荧光标记的Target分子与Ligand结合后，检测其热泳动速度变化来分析分子间相互作用。结合导致尺寸、水化层或电荷改变，进而产生MST信号。实验中，Ligand按浓度梯度稀释后与Target混合，通过温度梯度检测荧光强度变化并计算亲和常数KD值。
2.
基于活性的蛋白质谱
ABPP
ABPP（Activity-Based Protein Profiling）是一种基于蛋白质活性位点特异性标记的技术，用于鉴定和分析细胞中靶蛋白的功能状态。通过带有反应性基团的探针与蛋白质的活性位点共价结合，ABPP可以特异性地标记具有特定活性的蛋白质。标记后的蛋白质通过质谱或荧光成像等手段进行检测和鉴定，从而揭示药物作用靶点或细胞中特定功能蛋白的动态变化。
3.
细胞热迁移
CETSA
CETSA（Cell Thermal Shift assay）是利用蛋白质随温度升高变性的原理，鉴定活细胞中靶蛋白与药物的相互作用。蛋白质在细胞内稳定，但温度升高时会变性沉淀，当50%蛋白质变性时，该温度称为熔解温度（Tm），Tm越高，稳定性越好。配体结合可提高Tm值。CETSA实验中，药物处理后，靶蛋白热稳定性增强，Tm值增加。通过Western blot或MALDI-TOF-MS绘制熔解曲线，比较Tm变化，可判断药物与靶蛋白的相互作用。
4.
分子动力学模拟
MD Simulation
分子动力学模拟（Molecular Dynamics Simulation）是基于经典力学，通过数值求解分子体系的运动方程，研究其结构与性质。它利用牛顿运动定律追踪原子的动态变化，从原子尺度揭示微观机理。模拟中，原子被赋予初始位置和速度，根据相互作用力计算加速度，再通过数值积分（如Verlet算法）推进时间，模拟体系的演化过程。
参考文献
Zhang ZX, Li SY, Li FF, Shi QY, Tan CY, Wang XJ, Li M, Liu YB, Jin J, Li Y, Yu SS. Meisoindigo Acts as a Molecular Glue to Target PKMYT1 for Degradation in Chronic Myeloid Leukemia Therapy. Adv Sci (Weinh). 2025 Apr 25:e2413676.
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