天然产物作用靶点筛选及验证方法：ABPP+MST+ITC+CETSA+DARTS+小分子pull-down+分子对接

ABPP技术介绍

基于活性的蛋白质谱(activity-based protein profiling，ABPP)是一种化学蛋白质组学方法，它结合基于活性的探针(activity-based probe，ABP)和蛋白质组学技术来鉴定活性小分子的蛋白质靶标，以帮助阐明活性小分子发挥作用的机理。

ABPP主要实验步骤

1. 探针制备：活性分子探针的设计合成，以及探针活性鉴定

2. 将探针与总蛋白孵育（或与细胞孵育后提取总蛋白）

3. 上述孵育完成后，先后进行UV照射（使活性分子与靶蛋白共价相连）、 点击化学反应（给活性分子引入报告基团，如生物素）

4. 通过报告基团对靶蛋白进行富集鉴定

高分文献分享

JACS | ABPP（化学蛋白质组学）鉴定抗肿瘤天然产物作用靶点

2025年2月，中国药科大学团队在ACS Cent Sci发表题为“Discovery of Natural Resorcylic Acid Lactones as Novel Potent Copper Ionophores Covalently Targeting PRDX1 to Induce Cuproptosis for Triple-Negative Breast Cancer Therapy”的文章。从植物内生真菌Ilyonectria sp中分离出24个间环酸内酯类天然产物。通过ABPP技术揭示天然产物pochonin D靶向PRDX1，发挥功能的分子机制。

图1 天然抗肿瘤化合物筛选及鉴定

为了筛选鉴定PoD的作用靶点，作者首先合成了具有生物素标签的PoD探针（PoD-biotin），该探针保留了与PoD相当的抗肿瘤活性。随后作者通过垂钓结合质谱的手段筛选鉴定PoD靶蛋白：将MDA-MB-231和4T1细胞裂解物与PoD探针孵育，并使用生物素作为对照。处理后的细胞裂解物随后进行下拉和胰蛋白酶消化，然后进行质谱鉴定分析（图2A、2B、2C），其中PRDX1在两种细胞裂解液中均差异性富集。同时通过OTTER（基于组学和文本的靶点富集和排序）工具对RNA测序结果进行分析，同样富集了包括PRDX1在内的多个基因（图2D、2E）。综上，PRDX1为PoD的潜在作用靶点。

ABPP实验方法

3、PoD与PRDX1直接相互作用验证

为了证明PoD与PRDX1的直接相互作用，作者使用多种方法进行证明。通过MST微量热泳动实验，测得二者之间的亲和力KD为0.77±0.62uM（图3A、3B）；通过ITC等温滴定量热实验，进一步验证了二者的相互作用，KD值为0.675 uM（图3C、3D）；通过CETSA细胞热迁移和DARTS实验，证明PoD能提高PRDX1的热稳定性（图3E、3F），同时也能提高PRDX1对蛋白酶的水解抗性（图3G、3H）；最后也通过小分子pull-down（图3I、3J）实验证明了二者的结合。

4、蛋白和化合物结合关键氨基酸位点鉴定：PoD通过与PRDX1的Cys173形成共价键发挥功能

首先，作者比较了缺乏α，β-不饱和酮部分的衍生物monordene E的细胞毒性，发现其抑制肿瘤的活性明显降低（图4A），表明PoD的细胞毒性依赖此官能团（图4B）。同时PRDX1拥有四个Cys（经典的共价药物结合位点），作者随后使用共价对接模拟PRDX1在这四个位点和PoD的相互作用（图4C、4D、4E、4F），同时构建了4个突变体，进行了MST微量热泳动实验（图4G）、小分子pull-down（图4J）、CETSA细胞热迁移（图4H）和DARTS（图4I）实验，实验表明当173位Cys突变成Ala后，PRDX1和PoD的相互作用消失。综上PoD通过与PRDX1的Cys173形成共价键发挥功能。

图4 PoD通过与PRDX1的Cys173形成共价键发挥功能

5、PoD通过靶向PRDX1刺激铜死亡表现出抗TNBC活性

为了进一步研究PRDX1在TNBC细胞中的作用，作者构建了PRDX1敲低和过表达细胞，发现敲低PRDX1能降低PoD对细胞增殖的抑制作用，过表达则提高细胞对PoD的敏感性（图5B、C、D、E）；作者同时也进行了小鼠实验，在PRDX1敲低的小鼠中，PoD对于肿瘤的增殖没有明显抑制作用（图5M、5N），但过表达的小鼠中，对于PoD的敏感性显著增加（图5O、7P）。

图5 PoD通过靶向PRDX1刺激铜死亡表现出抗TNBC活性

[1] Feng L, Wu TZ, Guo XR, et al. Discovery of Natural Resorcylic Acid Lactones as Novel Potent Copper Ionophores Covalently Targeting PRDX1 to Induce Cuproptosis for Triple-Negative Breast Cancer Therapy. ACS Cent Sci. 2025;11(2):357-370. Published 2025 Feb 10. doi:10.1021/acscentsci.4c02188