蛋白与离子互作的筛选与验证方法分享：TPP热蛋白质组学+CETSA+ITC等温滴定量热

TPP是一种用于筛选化合物结合靶点的实验方法，核心原理基于配体-靶蛋白相互作用引发的靶蛋白热稳定性改变。结合了配体的蛋白和没结合配体的蛋白的热稳定有差异，将样品在不同温度下热处理并离心去除变性的蛋白质，通过定量蛋白质组技术检测上清中的蛋白，比较实验组和对照组上清中蛋白的含量差异从而筛选出候选配体结

合靶蛋白。

CETSA的核心原理基于配体-靶蛋白相互作用引发的热稳定性改变。核心原理基于配体-靶蛋白相互作用引发的靶蛋白热稳定性改变。结合了配体的蛋白和没结合配体的蛋白的热稳定有差异，将样品在不同温度下热处理并离心去除变性的蛋白质，通过定量蛋白质组技术检测上清中的蛋白，通过WB实验比较实验组和对照组上清中蛋白的含量差异从而鉴定配体和靶蛋白是否结合。

等温滴定量热法（ITC）基于分子结合时吸热或者放热现象进行生物分子间亲和力检测。样品池中加入被滴定物（如蛋白质），滴定针中加入滴定物（如药物）。每次滴定产生热量脉冲，通过积分和浓度归一化处理，生成摩尔放热量（kcal/mol）对摩尔比率（被滴定物/滴定物）的曲线。选择合适结合模型拟合后，可获得亲和力（KD）、化学计量比（n）、焓变（ΔH）和熵变（ΔS）。

高分文章案例分享

Nature Chemical Biology | TPP结合CETSA、ITC、结构分析筛选鉴定新的锌离子结合蛋白

2024年2月，北京大学在Nature Chemical Biology发表了题为“Discovery of metal-binding proteins by thermal proteome profiling”的研究论文。该研究基于热蛋白质组分析（TPP）筛选鉴定金属结合蛋白。通过监测螯合剂处理诱导的蛋白质稳定性动态变化筛选候选靶标，结合细胞热稳定性分析（CETSA）与等温滴定量热（ITC）验证GFPT2与锌离子的高亲和力结合（KD=1.5±0.6 μM）。进一步通过复合物结构解析，比较分析及位点突变实验阐明其锌配位关键位点（C301）。该工作建立"TPP初筛-互作验证-结构解析"多维技术联用策略，实现金属结合蛋白从发现到机制解析的全流程高效研究。

CETSA实验方法

A solution of the compound in dimethyl sulfoxide (DMSO) or DMSO alone as vehicle (Table 1) was added to the cell extract to 1% final DMSO concentration. The extract was then incubated for 10 min at 23°C, divided into 10 aliquots of 100 ml, and transferred into 0.2-ml polymerase chain reaction (PCR) tubes. One each of the compound and of the vehicle containing samples was heated in parallel for 3 min to the respective temperature, followed by a 3-min incubation time at room temperature. Subsequently, the extract was centrifuged at 200,000 g for 20 min at 4°C. The supernatant was fractionated by means of SDS gel electrophoresis and subjected to sample preparation for MS analysis.

鉴于GFPT1/2是己糖生物合成途径的关键限速酶（注：部分酶依赖金属离子作为辅因子以维持结构或催化功能），研究者通过将GFPT2瞬时转染至Hela细胞体系，研究者检测到锌离子显著抑制GFPT2活性（图2A），且抑制作用呈现浓度依赖性（图2B），提示锌离子与GFPT2存在特异性结合。为验证该相互作用，研究团队进一步通过等温滴定量热法（ITC）分析GFPT1同源蛋白GlmS与锌离子的结合特性（图2C）。实验采用Malvern ITC 200系统，在25℃条件下，将1 mM ZnSO4溶液以4 μL/次、共10次滴定至含0.046 mM GlmS蛋白的样品池中。采用单点结合模型拟合滴定曲线，计算得出平衡解离常数KD为1.5±0.6 μM，证实GlmS蛋白对Zn²⁺具有高亲和力结合能力。

ITC实验方法

ITC was carried out on an ITC200 Microcalorimeter (Malvern) to measure the zinc-binding affinity of GlmS. First, 1 mM ZnSO4 in the injection syringe was titrated into a sample cell containing 0.046 mM GlmS to achieve a complete binding isotherm in a buffer containing 20 mM HEPES (pH 7.2), 300 mM NaCl and 1 mM TCEP. All binding experiments were performed at constant temperature of 25 °C. Ten injections (4.0 μl each) were dispensed with a 5-s addition time and a spacing of 120 s. The experiment was repeated three times. The titration curves were fitted using MicroCal Origin software assuming a single binding site mode.

本研究中解析了GlmS-Zn²⁺的复合物晶体结构，结构显示GlmS通过C端同源二聚体界面结合三个Zn²⁺，每个离子均与邻近氨基酸（包括C301）及水分子氧原子形成配位网络（图3a）。与PDB数据库GlmS-Fru-6-P复合物结构比对发现，Zn²⁺结合位点与底物结合域存在空间冲突的可能（图3b）。提示锌离子可能通过竞争性的位阻阻止底物进入活性中心。功能实验验证表明C301A突变体显示降低的锌离子敏感性（与WT相比，锌处理酶活下降较小），证实该残基为锌配位的关键位点（图3c）。而此前报道的H505S突变导致失活现象揭示了，C301参与金属离子结合，而H505为底物结合的关键残基。